Հակահելմինտիկ դեղամիջոց N,N-դիէթիլ-մ-տոլուամիդ (ԴԻՏ) հաղորդվել է, որ այն արգելակում է AChE-ն (ացետիլխոլինէսթերազը) և ունի պոտենցիալ քաղցկեղածին հատկություններ՝ չափազանց մեծ անոթայինացման պատճառով: Այս հոդվածում մենք ցույց ենք տալիս, որ DEET-ը հատուկ խթանում է էնդոթելային բջիջները, որոնք խթանում են անգիոգենեզը՝ դրանով իսկ մեծացնելով ուռուցքի աճը: DEET-ն ակտիվացնում է անգիոգենեզի տանող բջջային պրոցեսները, ներառյալ տարածումը, միգրացիան և կպչունությունը: Սա կապված է էնդոթելային բջիջներում NO-ի արտադրության և VEGF արտահայտման ավելացման հետ: M3-ի լռեցումը կամ դեղաբանական M3 ինհիբիտորների օգտագործումը վերացրեց այս բոլոր էֆեկտները՝ ենթադրելով, որ DEET-ի ազդեցությամբ անգիոգենեզը M3-ին զգայուն է: M3 ընկալիչները գերարտահայտող էնդոթելային և HEK բջիջներում կալցիումի ազդանշանի հետ կապված փորձերը, ինչպես նաև կապակցման և կապակցման ուսումնասիրությունները ցույց են տալիս, որ DEET-ը գործում է որպես M3 ընկալիչների ալոստերիկ մոդուլատոր: Ավելին, DEET-ն արգելակում է AChE-ն՝ դրանով իսկ մեծացնելով ացետիլխոլինի կենսամատչելիությունը և նրա կապը M3 ընկալիչների հետ և ուժեղացնելով պրոանգիոգեն ազդեցությունը ալոստերիկ կարգավորման միջոցով:
Շվեյցարական մկների աորտայից մեկուսացվել են առաջնային ԷԿ: Արդյունահանման մեթոդը հարմարեցվել է Կոբայաշիի արձանագրությունից 26: Մկների EC-ները մշակվել են EBM-2 միջավայրում, որը լրացվել է 5% ջերմությամբ անակտիվացված FBS-ով մինչև չորրորդ անցումը:
DEET-ի երկու կոնցենտրացիաների ազդեցությունը HUVEC-ի, U87MG-ի կամ BF16F10-ի տարածման վրա վերլուծվել է CyQUANT բջիջների տարածման փորձարկման հավաքածուի միջոցով (Molecular Probes, C7026): Համառոտ, 5,103 բջիջ յուրաքանչյուր ջրհորի մեջ ցանվել է 96 հորատանցք ունեցող ափսեի մեջ, թույլ է տվել միացնել գիշերը, և այնուհետև մշակվել DEET-ով 24 ժամ: Աճող միջավայրը հեռացնելուց հետո միկրոափսեի յուրաքանչյուր հորին ավելացրեք ներկ կապող լուծույթ և ինկուբացրեք բջիջները 37 °C ջերմաստիճանում 30 րոպե: Ֆլյուորեսցենտային մակարդակները որոշվել են Mithras LB940 մուլտիպոդալ միկրոպլատների ընթերցիչի միջոցով (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Գերմանիա), որը հագեցած է 485 նմ գրգռման զտիչներով և 530 նմ արտանետման զտիչներով:
HUVEC-ը ցանվել է 96 ջրհորի թիթեղներում՝ մեկ ջրհորի 104 բջիջ խտությամբ: Բջիջները մշակվել են DEET-ով 24 ժամ: Բջիջների կենսունակությունը գնահատվել է գունամետրիկ MTT վերլուծության միջոցով (Sigma-Aldrich, M5655): Օպտիկական խտության արժեքները ստացվել են բազմաֆունկցիոնալ միկրոափսե ընթերցողի վրա (Mithras LB940) 570 նմ ալիքի երկարությամբ:
DEET-ի ազդեցությունները ուսումնասիրվել են in vitro անգիոգենեզի անալիզների միջոցով: 10-8 M կամ 10-5 M DEET-ով բուժումը մեծացրել է HUVEC-ներում մազանոթների երկարության ձևավորումը (նկ. 1a, b, սպիտակ ձողեր): Համեմատած հսկիչ խմբի հետ, 10-14-ից մինչև 10-5 Մ տատանվող DEET կոնցենտրացիաներով բուժումը ցույց տվեց, որ մազանոթի երկարությունը հասել է բարձրության 10-8 M DEET-ի վրա (Լրացուցիչ նկար S2): Ոչ մի էական տարբերություն չի հայտնաբերվել HUVEC-ների in vitro պրոանգիոգեն ազդեցության մեջ, որոնք մշակվել են DEET-ով 10-8 Մ և 10-5 Մ կոնցենտրացիաների միջակայքում:
Նեովասկուլյարիզացիայի վրա DEET-ի ազդեցությունը որոշելու համար մենք կատարեցինք in vivo նեովասկուլյարիզացիայի ուսումնասիրություններ: 14 օր հետո մկները, որոնց ներարկվել են էնդոթելային բջիջներ, որոնք մշակվել են 10-8 M կամ 10-5 M DEET-ով, ցույց են տվել հեմոգլոբինի պարունակության զգալի աճ (նկ. 1c, սպիտակ շերտեր):
Ավելին, DEET-ով առաջացած նեովասկուլյարիզացիան ուսումնասիրվել է U87MG քսենոփոխպատվաստում կրող մկների վրա, որոնց ամեն օր (IP) ներարկվել է DEET մի դոզանով, որը հայտնի է, որ հրահրում է պլազմայում 10-5 Մ կոնցենտրացիաներ, ինչը նորմալ է ենթարկված մարդկանց համար: 23-ում: Հայտնաբերելի ուռուցքներ (այսինքն՝ ուռուցքներ >100 մմ3) դիտվել են մկների մեջ U87MG բջիջների ներարկումից 14 օր հետո: 28-րդ օրը ուռուցքի աճը զգալիորեն ուժեղացել է DEET-ով բուժված մկների մոտ՝ համեմատած հսկիչ մկների հետ (նկ. 1d, քառակուսիներ): Ավելին, ուռուցքների CD31 ներկումը ցույց տվեց, որ DEET-ը զգալիորեն մեծացնում է մազանոթների տարածքը, բայց ոչ միկրոանոթների խտությունը: (նկ. 1e–g):
Մուսկարինային ընկալիչների դերը DETA-ի պատճառած տարածման մեջ որոշելու համար օգտագործվել է 10-8 M կամ 10-5 M DETA pFHHSiD-ի առկայության դեպքում (10-7 M, M3 ընկալիչների ընտրովի հակառակորդ): HUVEC-ի բուժում. pFHHSiD-ն ամբողջությամբ արգելափակել է DETA-ի պրոլիֆերատիվ հատկությունները բոլոր կոնցենտրացիաներում (Աղյուսակ 1):
Այս պայմաններում մենք նաև ուսումնասիրեցինք, թե արդյոք DEET-ը կավելացնի մազանոթների երկարությունը HUVEC բջիջներում: Նմանապես, pFHHSiD-ը զգալիորեն կանխեց DEET-ի կողմից առաջացած մազանոթի երկարությունը (նկ. 1a, b, մոխրագույն գծեր): Ավելին, նմանատիպ փորձեր են իրականացվել M3 siRNA-ի հետ: Չնայած վերահսկիչ siRNA-ն արդյունավետ չէր մազանոթների ձևավորմանը նպաստելու համար, M3 մուսկարինային ընկալիչի լռեցումը վերացրեց DEET-ի կարողությունը մեծացնելու մազանոթների երկարությունը (նկ. 1a, b, սև գծեր):
Ավելին, և՛ 10-8 M, և՛ 10-5 M DEET-ով պայմանավորված անոթավորումը in vitro, և նեովասկուլյարիզացիան in vivo-ն ամբողջությամբ արգելափակվել են pFHHSiD-ի կողմից (նկ. 1c, d, շրջանակներ): Այս արդյունքները ցույց են տալիս, որ DEET-ը խթանում է անգիոգենեզը M3 ընկալիչների ընտրովի հակառակորդների կամ M3 siRNA-ի նկատմամբ զգայուն ուղու միջոցով:
AChE-ն DEET-ի մոլեկուլային թիրախն է: Դոնեպեզիլի նման դեղամիջոցները, որոնք գործում են որպես AChE ինհիբիտորներ, կարող են խթանել ԷԿ անգիոգենեզը in vitro և մկների հետին վերջույթների իշեմիայի մոդելներում14: Մենք փորձարկեցինք DEET-ի երկու կոնցենտրացիաների ազդեցությունը AChE ֆերմենտի ակտիվության վրա HUVEC-ում: DEET-ի ցածր (10-8 Մ) և բարձր (10-5 Մ) կոնցենտրացիաները նվազեցնում են էնդոթելային AChE-ի ակտիվությունը՝ համեմատած հսկիչ պայմանների հետ (նկ. 2):
DEET-ի երկու կոնցենտրացիաները (10-8 Մ և 10-5 Մ) նվազեցրին ացետիլխոլինէսթերազի ակտիվությունը HUVEC-ի վրա: BW284c51 (10-5 M) օգտագործվել է որպես ացետիլխոլինէսթերազի ինհիբիտորների հսկողություն: Արդյունքներն արտահայտվում են որպես AChE ակտիվության տոկոս HUVEC-ի վրա, որը մշակվում է DEET-ի երկու կոնցենտրացիաներով՝ համեմատած փոխադրամիջոցով մշակված բջիջների հետ: Արժեքներն արտահայտվում են որպես վեց անկախ փորձերի միջին ± SEM: *p < 0.05 համեմատ վերահսկողության հետ (Kruskal-Wallis և Dunn բազմակի համեմատական թեստ):
Ազոտի օքսիդը (NO) ներգրավված է անգիոգեն գործընթացում 33, հետևաբար, ուսումնասիրվել է NO արտադրությունը DEET-ով խթանված HUVEC-ներում: DEET-ով բուժված էնդոթելային NO արտադրությունն ավելացել է հսկիչ բջիջների համեմատ, բայց նշանակալի է հասել միայն 10-8 Մ դոզանով (նկ. 3c): DEET-ի ազդեցությամբ NO արտադրությունը վերահսկող մոլեկուլային փոփոխությունները որոշելու համար eNOS-ի արտահայտությունը և ակտիվացումը վերլուծվել են Western blotting-ով: Թեև DEET բուժումը չի փոխել eNOS-ի արտահայտությունը, այն զգալիորեն մեծացրել է eNOS ֆոսֆորիլացումը իր ակտիվացնող տեղում (Ser-1177)՝ միաժամանակ նվազեցնելով դրա արգելակման վայրը (Thr-495)՝ համեմատած eNOS ֆոսֆորիլացման չմշակված բջիջների հետ (նկ. 3d): Ավելին, ֆոսֆորիլացված eNOS-ի հարաբերակցությունը ակտիվացման և արգելակման վայրում հաշվարկվել է ֆոսֆորիլացված eNOS-ի քանակությունը ֆերմենտի ընդհանուր քանակին նորմալացնելուց հետո: Այս հարաբերակցությունը զգալիորեն ավելացել է HUVEC-ներում, որոնք մշակվել են DEET-ի յուրաքանչյուր կոնցենտրացիայով, համեմատած չմշակված բջիջների հետ (նկ. 3d):
Վերջապես, VEGF-ի արտահայտումը, որը հանդիսանում է հիմնական պրոանգիոգեն գործոններից մեկը, վերլուծվել է Western blotting-ով: DEET-ը զգալիորեն մեծացրել է VEGF արտահայտությունը, մինչդեռ pFHHSiD-ն ամբողջությամբ արգելափակել է այս արտահայտությունը:
Քանի որ DEET-ի էֆեկտները զգայուն են ինչպես դեղաբանական շրջափակման, այնպես էլ M3 ընկալիչների նվազեցման նկատմամբ, մենք փորձարկեցինք այն վարկածը, որ DEET-ը կարող է ուժեղացնել կալցիումի ազդանշանը: Զարմանալիորեն, DEET-ին չհաջողվեց բարձրացնել ցիտոպլազմային կալցիումը HUVEC-ում (տվյալները ցույց չեն տրված) և HEK/M3-ում (նկ. 4ա, բ) օգտագործված երկու կոնցենտրացիաների համար:
Հրապարակման ժամանակը՝ Դեկտեմբեր-30-2024