Հակահելմինտիկ դեղամիջոց՝ N,N-դիէթիլ-m-տոլուամիդ (ԴԵԵՏ)-ը, ըստ հաղորդումների, արգելակում է AChE-ն (ացետիլխոլինէսթերազ) և ունի պոտենցիալ քաղցկեղածին հատկություններ՝ չափազանց անոթավորման պատճառով: Այս հոդվածում մենք ցույց ենք տալիս, որ DEET-ը հատուկ խթանում է էնդոթելային բջիջները, որոնք խթանում են անգիոգենեզը, դրանով իսկ մեծացնելով ուռուցքի աճը: DEET-ը ակտիվացնում է բջջային գործընթացները, որոնք հանգեցնում են անգիոգենեզի, ներառյալ բազմացումը, միգրացիան և ադհեզիան: Սա կապված է NO արտադրության և VEGF արտահայտման աճի հետ էնդոթելային բջիջներում: M3-ի լռեցումը կամ դեղաբանական M3 արգելակիչների օգտագործումը վերացնում է այս բոլոր ազդեցությունները, ինչը ենթադրում է, որ DEET-ի կողմից առաջացած անգիոգենեզը զգայուն է M3-ի նկատմամբ: Կալցիումի ազդանշանային ուղու վրա հիմնված փորձերը էնդոթելային և HEK բջիջներում, որոնք գերարտահայտում են M3 ընկալիչները, ինչպես նաև կապման և դոկինգի ուսումնասիրությունները ցույց են տալիս, որ DEET-ը գործում է որպես M3 ընկալիչների ալոստերիկ մոդուլյատոր: Ավելին, DEET-ը արգելակում է AChE-ն, դրանով իսկ մեծացնելով ացետիլխոլինի կենսամատչելիությունը և դրա կապումը M3 ընկալիչների հետ, և ուժեղացնելով պրոանգիոգենեզային ազդեցությունները՝ ալոստերիկ կարգավորման միջոցով:
Առաջնային էկզեմատիկ բջիջները (ԷԲ) մեկուսացվել են շվեյցարական մկների աորտայից: Էքստրակցիայի մեթոդը վերցված է Կոբայաշիի արձանագրությունից [26]: Մկների ԷԲ-ները կուլտիվացվել են EBM-2 միջավայրում՝ լրացված 5% ջերմային ինակտիվացված FBS-ով մինչև չորրորդ անցումը:
DEET-ի երկու կոնցենտրացիաների ազդեցությունը HUVEC-ի՝ U87MG-ի կամ BF16F10-ի բազմացման վրա վերլուծվել է CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit-ի (Molecular Probes, C7026) միջոցով: Հակիրճ ասած, յուրաքանչյուր խոռոչի 5.103 բջիջ ցանվել է 96 խոռոչից բաղկացած ափսեի մեջ, թողնվել է գիշերը կպչելու, ապա մշակվել է DEET-ով 24 ժամ: Աճման միջավայրը հեռացնելուց հետո, միկրոսրահի յուրաքանչյուր խոռոչին ավելացնել ներկանյութ կապող լուծույթ և բջիջները ինկուբացել 37°C ջերմաստիճանում 30 րոպե: Ֆլուորեսցենցիայի մակարդակները որոշվել են Mithras LB940 բազմամոդ միկրոսրահի կարդացիչ սարքի (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Գերմանիա) միջոցով, որը հագեցած է 485 նմ գրգռման ֆիլտրերով և 530 նմ ճառագայթման ֆիլտրերով:
HUVEC-ները ցանվել են 96-խոռոչանոց թիթեղների մեջ՝ մեկ խոռոչում 104 բջիջ խտությամբ: Բջիջները մշակվել են DEET-ով 24 ժամ: Բջիջների կենսունակությունը գնահատվել է գունաչափական MTT անալիզով (Sigma-Aldrich, M5655): Օպտիկական խտության արժեքները ստացվել են բազմամոդ միկրոթիթեղային ընթերցողի (Mithras LB940) վրա՝ 570 նմ ալիքի երկարությամբ:
DEET-ի ազդեցությունն ուսումնասիրվել է in vitro անգիոգենեզի անալիզների միջոցով: 10-8 Մ կամ 10-5 Մ DEET-ով մշակումը մեծացրել է HUVEC-ներում մազանոթների երկարության առաջացումը (Նկար 1ա, բ, սպիտակ սյուներ): Հսկիչ խմբի համեմատ, 10-14-ից մինչև 10-5 Մ DEET կոնցենտրացիաներով մշակումը ցույց է տվել, որ մազանոթների երկարությունը հասել է պլատոյի 10-8 Մ DEET-ի վրա (Լրացուցիչ նկար S2): 10-8 Մ և 10-5 Մ կոնցենտրացիաների միջակայքում DEET-ով մշակված HUVEC-ների in vitro պրոանգիոգենեզային ազդեցության մեջ էական տարբերություն չի հայտնաբերվել:
DEET-ի ազդեցությունը նեովասկուլյարիզացիայի վրա որոշելու համար մենք անցկացրեցինք in vivo նեովասկուլյարիզացիայի ուսումնասիրություններ: 14 օր անց 10-8 M կամ 10-5 M DEET-ով նախնական կուլտուրայով էնդոթելային բջիջներ ներարկված մկների մոտ հեմոգլոբինի պարունակության զգալի աճ նկատվեց (Նկ. 1c, սպիտակ շերտեր):
Ավելին, DEET-ով առաջացած նեովասկուլյարիզացիան ուսումնասիրվել է U87MG քսենոտրանսպլանտատ կրող մկների մոտ, որոնց ամեն օր (ներմեջ) ներարկվել է DEET՝ 10-5 Մ պլազմային կոնցենտրացիաներ առաջացնող դեղաչափով, որը նորմալ է մարդկանց մոտ: 23-ում U87MG բջիջների մկների մեջ ներարկումից 14 օր անց նկատվել են հայտնաբերելի ուռուցքներ (այսինքն՝ ուռուցքներ >100 մմ3): 28-րդ օրը DEET-ով բուժված մկների մոտ ուռուցքի աճը զգալիորեն արագացել էր՝ համեմատած վերահսկիչ մկների հետ (Նկար 1դ, քառակուսիներ): Ավելին, ուռուցքների CD31 ներկումը ցույց է տվել, որ DEET-ը զգալիորեն մեծացրել է մազանոթային մակերեսը, բայց ոչ միկրոանոթային խտությունը (Նկար 1ե-գ):
DETA-ի կողմից ինդուկցված պրոլիֆերացիայի մեջ մուսկարինային ընկալիչների դերը որոշելու համար օգտագործվել է 10-8 Մ կամ 10-5 Մ DETA pFHHSiD-ի (10-7 Մ, ընտրողական M3 ընկալիչի անտագոնիստ) առկայությամբ: HUVEC-ի բուժումը: pFHHSiD-ն ամբողջությամբ արգելափակել է DETA-ի պրոլիֆերատիվ հատկությունները բոլոր կոնցենտրացիաներում (աղյուսակ 1):
Այս պայմաններում մենք նաև ուսումնասիրեցինք, թե արդյոք DEET-ը կմեծացնի մազանոթների երկարությունը HUVEC բջիջներում: Նմանապես, pFHHSiD-ն զգալիորեն կանխեց DEET-ի կողմից առաջացած մազանոթների երկարությունը (Նկար 1ա, բ, մոխրագույն շերտեր): Ավելին, նմանատիպ փորձեր կատարվեցին M3 siRNA-ի հետ: Չնայած վերահսկիչ siRNA-ն արդյունավետ չէր մազանոթների ձևավորումը խթանելու հարցում, M3 մուսկարինային ընկալիչի լռեցումը վերացրեց DEET-ի մազանոթների երկարությունը մեծացնելու ունակությունը (Նկար 1ա, բ, սև շերտեր):
Ավելին, ինչպես 10-8 M կամ 10-5 M DEET-ով առաջացած անոթայինացումը in vitro, այնպես էլ նեովասկուլյարացումը in vivo ամբողջությամբ արգելափակվել են pFHHSiD-ի կողմից (Նկ. 1c, d, շրջանակներ): Այս արդյունքները ցույց են տալիս, որ DEET-ը խթանում է անգիոգենեզը ընտրողական M3 ընկալիչների անտագոնիստների կամ M3 siRNA-ի նկատմամբ զգայուն ուղու միջոցով:
AChE-ն DEET-ի մոլեկուլային թիրախն է: Դոնեպեզիլի նման դեղամիջոցները, որոնք գործում են որպես AChE ինհիբիտորներ, կարող են խթանել էնդոթելային էնդոթելային անգիոգենեզը in vitro և մկների հետին վերջույթների իշեմիայի մոդելներում14: Մենք փորձարկել ենք DEET-ի երկու կոնցենտրացիաների ազդեցությունը AChE ֆերմենտային ակտիվության վրա HUVEC-ում: DEET-ի ցածր (10-8 Մ) և բարձր (10-5 Մ) կոնցենտրացիաները նվազեցրել են էնդոթելային AChE ակտիվությունը՝ համեմատած վերահսկիչ պայմանների հետ (Նկար 2):
DEET-ի երկու կոնցենտրացիաներն էլ (10-8 Մ և 10-5 Մ) նվազեցրել են ացետիլխոլինէսթերազի ակտիվությունը HUVEC-ի վրա: BW284c51-ը (10-5 Մ) օգտագործվել է որպես ացետիլխոլինէսթերազի ինհիբիտորների վերահսկիչ: Արդյունքները արտահայտվում են որպես AChE ակտիվության տոկոս HUVEC-ի վրա, որը մշակվել է DEET-ի երկու կոնցենտրացիաներով, համեմատած տրանսպորտային միջոցով մշակված բջիջների հետ: Արժեքները արտահայտվում են որպես վեց անկախ փորձերի միջին ± SEM: *p < 0.05՝ համեմատած վերահսկիչ խմբի հետ (Կրուսկալ-Ուոլիսի և Դանի բազմակի համեմատական թեստ):
Ազոտի օքսիդը (NO) մասնակցում է անգիոգենեզի գործընթացին 33, հետևաբար, ուսումնասիրվել է NO արտադրությունը DEET-խթանված HUVEC-ներում: DEET-ով մշակված էնդոթելային NO արտադրությունը մեծացել է վերահսկիչ բջիջների համեմատ, բայց նշանակալի է դարձել միայն 10-8 M դեղաչափի դեպքում (Նկար 3c): DEET-ով ինդուկցված NO արտադրությունը կարգավորող մոլեկուլային փոփոխությունները որոշելու համար eNOS-ի արտահայտությունը և ակտիվացումը վերլուծվել են Western blotting-ի միջոցով: Չնայած DEET-ով բուժումը չի փոխել eNOS-ի արտահայտությունը, այն զգալիորեն մեծացրել է eNOS ֆոսֆորիլացումը դրա ակտիվացման վայրում (Ser-1177)՝ միաժամանակ նվազեցնելով դրա արգելակող տեղը (Thr-495)՝ համեմատած չմշակված բջիջների հետ eNOS ֆոսֆորիլացման ժամանակ (Նկար 3d): Ավելին, ակտիվացման վայրում և արգելակող վայրում ֆոսֆորիլացված eNOS-ի հարաբերակցությունը հաշվարկվել է ֆոսֆորիլացված eNOS-ի քանակը ֆերմենտի ընդհանուր քանակի նկատմամբ նորմալացնելուց հետո: Այս հարաբերակցությունը զգալիորեն մեծացել է DEET-ի յուրաքանչյուր կոնցենտրացիայով մշակված HUVEC-ներում՝ համեմատած չմշակված բջիջների հետ (Նկար 3d):
Վերջապես, VEGF-ի՝ հիմնական պրոանգիոգենեզ գործոններից մեկի, արտահայտությունը վերլուծվել է Western blotting-ի միջոցով: DEET-ը զգալիորեն մեծացրել է VEGF-ի արտահայտությունը, մինչդեռ pFHHSiD-ն ամբողջությամբ արգելափակել է այս արտահայտությունը:
Քանի որ DEET-ի ազդեցությունը զգայուն է ինչպես դեղաբանական շրջափակման, այնպես էլ M3 ընկալիչների թուլացման նկատմամբ, մենք ստուգեցինք այն վարկածը, որ DEET-ը կարող է ուժեղացնել կալցիումի ազդանշանային փոխանցումը: Հետաքրքիր է, որ DEET-ը չկարողացավ մեծացնել ցիտոպլազմային կալցիումը HUVEC-ում (տվյալները չեն ներկայացված) և HEK/M3-ում (Նկար 4ա, բ)՝ օգտագործված երկու կոնցենտրացիաների դեպքում էլ:
Հրապարակման ժամանակը. Դեկտեմբերի 30-2024