Այս ուսումնասիրության մեջ համակցված բուժման խթանող ազդեցություններըբույսերի աճի կարգավորիչներՀետազոտվել են *Hypericum perforatum* L.-ում in vitro մորֆոգենեզի և երկրորդային մետաբոլիտների արտադրության վրա (2,4-D և կինետին) և երկաթի օքսիդի նանոմասնիկների (Fe₃O₄-ՆՊ) ազդեցությունը: Օպտիմիզացված մշակումը [2,4-D (0.5 մգ/լ) + կինետին (2 մգ/լ) + Fe₃O₄-ՆՊ (4 մգ/լ)] զգալիորեն բարելավել է բույսի աճի պարամետրերը. բույսի բարձրությունն աճել է 59.6%-ով, արմատի երկարությունը՝ 114.0%-ով, բողբոջների քանակը՝ 180.0%-ով, իսկ կոշտուկի թարմ քաշը՝ 198.3%-ով՝ համեմատած վերահսկիչ խմբի հետ: Այս համակցված մշակումը նաև բարելավել է վերականգնման արդյունավետությունը (50.85%) և հիպերիցինի պարունակությունը 66.6%-ով: Գլյուկոզա-Մակարդակային սպիրտի (GC-MS) վերլուծությունը ցույց տվեց հիպերոզիդի, β-պաթոլենի և ցետիլային սպիրտի բարձր պարունակություն, որը կազմում է ընդհանուր պիկի մակերեսի 93.36%-ը, մինչդեռ ընդհանուր ֆենոլների և ֆլավոնոիդների պարունակությունը աճել է մինչև 80.1%-ով: Այս արդյունքները ցույց են տալիս, որ բույսերի աճի կարգավորիչները (PGR) և Fe₃O₄ նանոմասնիկները (Fe₃O₄-NPs) ունեն սիներգետիկ ազդեցություն՝ խթանելով օրգանոգենեզը և կենսաակտիվ միացությունների կուտակումը, ինչը խոստումնալից ռազմավարություն է դեղաբույսերի կենսատեխնոլոգիական կատարելագործման համար:
Սուրբ Հովհաննեսի խոտը (Hypericum perforatum L.), որը հայտնի է նաև որպես Սուրբ Հովհաննեսի խոտ, Hypericaceae ընտանիքի բազմամյա խոտաբույս է, որն ունի տնտեսական արժեք:[1] Դրա պոտենցիալ կենսաակտիվ բաղադրիչներն են բնական տանինները, քսանթոնները, ֆլորոգլյուցինոլը, նավթալենդիանտրոնը (հիպերին և պսևդոհիպերին), ֆլավոնոիդները, ֆենոլաթթուները և եթերային յուղերը:[2,3,4] Սուրբ Հովհաննեսի խոտը կարող է բազմացվել ավանդական մեթոդներով. սակայն ավանդական մեթոդների սեզոնայնությունը, սերմերի ցածր ծլունակությունը և հիվանդությունների նկատմամբ զգայունությունը սահմանափակում են դրա ներուժը մեծածավալ մշակման և երկրորդային մետաբոլիտների անընդհատ ձևավորման համար:[1,5,6]
Այսպիսով, in vitro հյուսվածքային կուլտուրան համարվում է բույսերի արագ բազմացման, գերմպլազմային ռեսուրսների պահպանման և բուժիչ միացությունների բերքատվության բարձրացման արդյունավետ մեթոդ [7, 8]: Բույսերի աճի կարգավորիչները (ԲԱԿ) կարևոր դեր են խաղում մորֆոգենեզի կարգավորման գործում և անհրաժեշտ են կոշտուկի և ամբողջական օրգանիզմների in vitro մշակման համար: Դրանց կոնցենտրացիաների և համակցությունների օպտիմալացումը կարևոր է այս զարգացման գործընթացների հաջող ավարտի համար [9]: Հետևաբար, կարգավորիչների համապատասխան կազմի և կոնցենտրացիայի հասկացումը կարևոր է Սուրբ Հովհաննեսի խնկունու (H. perforatum) աճի և վերականգնողական կարողության բարելավման համար [10]:
Երկաթի օքսիդի նանոմասնիկները (Fe₃O₄) նանոմասնիկների դաս են, որոնք մշակվել կամ մշակվում են հյուսվածքային կուլտուրաների համար: Fe₃O₄-ն ունի նշանակալի մագնիսական հատկություններ, լավ կենսահամատեղելիություն և բույսերի աճը խթանելու և շրջակա միջավայրի սթրեսը նվազեցնելու ունակություն, ուստի այն զգալի ուշադրություն է գրավել հյուսվածքային կուլտուրաների նախագծման մեջ: Այս նանոմասնիկների հնարավոր կիրառությունները կարող են ներառել in vitro կուլտուրայի օպտիմալացումը՝ բջիջների բաժանումը խթանելու, սննդանյութերի կլանումը բարելավելու և հակաօքսիդանտ ֆերմենտները ակտիվացնելու համար [11]:
Չնայած նանոմասնիկները ցույց են տվել բույսերի աճի վրա լավ խթանող ազդեցություն, *H. perforatum*-ում Fe₃O₄ նանոմասնիկների և օպտիմալացված բույսերի աճի կարգավորիչների համակցված կիրառման վերաբերյալ ուսումնասիրությունները դեռևս սակավաթիվ են: Այս գիտելիքների բացը լրացնելու համար այս ուսումնասիրությունը գնահատել է դրանց համակցված ազդեցության ազդեցությունը in vitro մորֆոգենեզի և երկրորդային մետաբոլիտների արտադրության վրա՝ դեղաբույսերի բնութագրերի բարելավման նոր պատկերացումներ տրամադրելու համար: Հետևաբար, այս ուսումնասիրությունն ունի երկու նպատակ՝ (1) օպտիմալացնել բույսերի աճի կարգավորիչների կոնցենտրացիան՝ in vitro արդյունավետորեն խթանելու կոշտուկի առաջացումը, ընձյուղների վերականգնումը և արմատավորումը, և (2) գնահատել Fe₃O₄ նանոմասնիկների ազդեցությունը աճի պարամետրերի վրա in vitro: Ապագա ծրագրերը ներառում են վերականգնված բույսերի գոյատևման մակարդակի գնահատումը ակլիմատիզացիայի ընթացքում (in vitro): Ակնկալվում է, որ այս ուսումնասիրության արդյունքները զգալիորեն կբարելավեն *H. perforatum*-ի միկրոբազմացման արդյունավետությունը, դրանով իսկ նպաստելով այս կարևոր դեղաբույսի կայուն օգտագործմանը և կենսատեխնոլոգիական կիրառություններին:
Այս ուսումնասիրության մեջ մենք ստացանք դաշտում աճեցված Սուրբ Հովհաննեսի միամյա խնկունու բույսերից (մայր բույսեր) տերևային էքսպլանտներ: Այս էքսպլանտները օգտագործվել են in vitro կուլտուրայի պայմանները օպտիմալացնելու համար: Մշակույթից առաջ տերևները մի քանի րոպե մանրակրկիտ լվացվել են հոսող թորած ջրի տակ: Այնուհետև էքսպլանտների մակերեսները ախտահանվել են՝ 30 վայրկյան ընկղմելով 70% էթանոլի մեջ, որին հաջորդել է 10 րոպե ընկղմելով 1.5% նատրիումի հիպոքլորիտի (NaOCl) լուծույթի մեջ, որը պարունակում է Tween 20-ի մի քանի կաթիլ: Վերջապես, էքսպլանտները երեք անգամ լվացվել են ստերիլ թորած ջրով՝ նախքան հաջորդ կուլտուրայի միջավայր տեղափոխելը:
Հաջորդ չորս շաբաթների ընթացքում չափվել են ընձյուղների վերականգնման պարամետրերը, այդ թվում՝ վերականգնման արագությունը, ընձյուղների քանակը մեկ էքսպլանտի համար և ընձյուղների երկարությունը: Երբ վերականգնված ընձյուղները հասել են առնվազն 2 սմ երկարության, դրանք տեղափոխվել են արմատակալման միջավայր, որը բաղկացած է եղել կիսաֆաբրիկատային զանգվածային միջավայրից, 0.5 մգ/լ ինդոլեբուտիրաթթուից (IBA) և 0.3% գուարի խեժից: Արմատակալման կուլտուրան շարունակվել է երեք շաբաթ, որի ընթացքում չափվել են արմատակալման արագությունը, արմատների քանակը և արմատների երկարությունը: Յուրաքանչյուր մշակում կրկնվել է երեք անգամ՝ յուրաքանչյուր կրկնության դեպքում կուլտուրավորելով 10 էքսպլանտ, ինչը յուրաքանչյուր մշակման ընթացքում տվել է մոտավորապես 30 էքսպլանտ:
Բույսի բարձրությունը չափվել է սանտիմետրերով (սմ)՝ օգտագործելով քանոն՝ բույսի հիմքից մինչև ամենաբարձր տերևի ծայրը: Արմատի երկարությունը չափվել է միլիմետրերով (մմ) անմիջապես սածիլները զգուշորեն հեռացնելուց և աճեցման միջավայրը հեռացնելուց հետո: Յուրաքանչյուր էքսպլանտի վրա անմիջապես հաշվարկվել է բողբոջների քանակը: Տերևների վրա սև բծերի քանակը, որոնք հայտնի են որպես հանգույցներ, չափվել է տեսողականորեն: Ենթադրվում է, որ այս սև հանգույցները հիպերիցին կամ օքսիդատիվ բծեր պարունակող գեղձեր են և օգտագործվում են որպես բույսի բուժմանը արձագանքի ֆիզիոլոգիական ցուցիչ: Աճեցման ողջ միջավայրը հեռացնելուց հետո սածիլների թարմ քաշը չափվել է էլեկտրոնային կշեռքի միջոցով՝ միլիգրամների (մգ) ճշգրտությամբ:
Կալուսի առաջացման արագությունը հաշվարկելու մեթոդը հետևյալն է. էքսպլանտատները չորս շաբաթ տարբեր աճի կարգավորիչներ (կինազներ, 2,4-D և Fe3O4) պարունակող միջավայրում կուլտիվացնելուց հետո հաշվարկվում է կալուսի առաջացման ունակ էքսպլանտների քանակը: Կալուսի առաջացման արագությունը հաշվարկելու բանաձևը հետևյալն է.
Յուրաքանչյուր բուժումը կրկնվել է երեք անգամ, յուրաքանչյուր կրկնության ընթացքում հետազոտվել է առնվազն 10 էքսպլանտ։
Վերականգնման արագությունը արտացոլում է կոշտուկի հյուսվածքի այն համամասնությունը, որը կոշտուկի ձևավորման փուլից հետո հաջողությամբ ավարտում է բողբոջների դիֆերենցման գործընթացը: Այս ցուցանիշը ցույց է տալիս կոշտուկի հյուսվածքի՝ դիֆերենցված հյուսվածքի վերածվելու և բույսի նոր օրգաններ աճելու ունակությունը:
Արմատավորման գործակիցը արմատակալելու ընդունակ ճյուղերի թվի և ճյուղերի ընդհանուր թվի հարաբերությունն է: Այս ցուցանիշը արտացոլում է արմատակալման փուլի հաջողությունը, որը կարևոր է միկրոբազմացման և բույսերի բազմացման մեջ, քանի որ լավ արմատավորումը օգնում է սածիլներին ավելի լավ գոյատևել աճեցման պայմաններում:
Հիպերիցինի միացությունները արդյունահանվել են 90% մեթանոլով: Հիսուն մգ չորացրած բուսական նյութ ավելացվել է 1 մլ մեթանոլի մեջ և ուլտրաձայնային մշակման ենթարկվել 20 րոպե 30 կՀց հաճախականությամբ ուլտրաձայնային մաքրող սարքի (մոդել A5120-3YJ) մեջ սենյակային ջերմաստիճանում, մթության մեջ: Ուլտրաձայնային մշակումից հետո նմուշը ցենտրիֆուգացվել է 6000 պտ/րոպե արագությամբ 15 րոպե: Վերին շերտը հավաքվել է, և հիպերիցինի կլանումը չափվել է 592 նմ-ում՝ օգտագործելով Plus-3000 S սպեկտրոֆոտոմետր՝ համաձայն Կոնսեյսաոյի և այլոց [14] կողմից նկարագրված մեթոդի:
Բույսերի աճի կարգավորիչներով (PGR) և երկաթի օքսիդի նանոմասնիկներով (Fe₃O₄-NPs) մշակումների մեծ մասը չի առաջացրել սև հանգույցների առաջացում վերականգնված ընձյուղների տերևների վրա: 0.5 կամ 1 մգ/լ 2,4-D, 0.5 կամ 1 մգ/լ կինետինով կամ 1, 2 կամ 4 մգ/լ երկաթի օքսիդի նանոմասնիկներով մշակումներից ոչ մեկում հանգույցներ չեն նկատվել: Մի քանի համակցություններ ցույց են տվել հանգույցների զարգացման աննշան աճ (բայց ոչ վիճակագրորեն նշանակալի) կինետինի և/կամ երկաթի օքսիդի նանոմասնիկների ավելի բարձր կոնցենտրացիաների դեպքում, ինչպիսին է 2,4-D-ի (0.5–2 մգ/լ) համակցությունը կինետինի (1–1.5 մգ/լ) և երկաթի օքսիդի նանոմասնիկների (2–4 մգ/լ) հետ: Այս արդյունքները ներկայացված են նկար 2-ում: Սև հանգույցները ներկայացնում են հիպերիցինով հարուստ գեղձեր, որոնք և՛ բնականորեն առաջացող են, և՛ օգտակար: Այս ուսումնասիրության մեջ սև հանգույցները հիմնականում կապված էին հյուսվածքների շագանակագույնացման հետ, ինչը ցույց է տալիս հիպերիցինի կուտակման համար բարենպաստ միջավայր: 2,4-D, կինետինով և Fe₃O₄ նանոմասնիկներով մշակումը խթանել է կոշտուկի աճը, նվազեցրել է շագանակագույնացումը և ավելացրել քլորոֆիլի պարունակությունը, ինչը ենթադրում է նյութափոխանակության ֆունկցիայի բարելավում և օքսիդատիվ վնասի հնարավոր նվազում [37]: Այս ուսումնասիրությունը գնահատել է կինետինի ազդեցությունը 2,4-D և Fe₃O₄ նանոմասնիկների հետ համատեղ Սուրբ Հովհաննեսի խնկունու կոշտուկի աճի և զարգացման վրա (Նկար 3a-g): Նախորդ ուսումնասիրությունները ցույց են տվել, որ Fe₃O₄ նանոմասնիկներն ունեն հակասնկային և հակամանրէային ակտիվություն [38, 39] և, երբ օգտագործվում են բույսերի աճի կարգավորիչների հետ համատեղ, կարող են խթանել բույսերի պաշտպանական մեխանիզմները և նվազեցնել բջջային սթրեսի ինդեքսները [18]: Չնայած երկրորդային մետաբոլիտների կենսասինթեզը գենետիկորեն կարգավորվում է, դրանց իրական արդյունքը մեծապես կախված է շրջակա միջավայրի պայմաններից: Նյութափոխանակության և ձևաբանական փոփոխությունները կարող են ազդել երկրորդային մետաբոլիտների մակարդակների վրա՝ կարգավորելով բույսերի որոշակի գեների արտահայտությունը և արձագանքելով շրջակա միջավայրի գործոններին: Ավելին, ինդուկտորները կարող են առաջացնել նոր գեների ակտիվացում, որոնք, իրենց հերթին, խթանում են ֆերմենտատիվ ակտիվությունը, ի վերջո ակտիվացնելով բազմաթիվ կենսասինթետիկ ուղիներ և հանգեցնելով երկրորդային մետաբոլիտների ձևավորմանը: Ավելին, մեկ այլ ուսումնասիրություն ցույց տվեց, որ ստվերի նվազեցումը մեծացնում է արևի լույսի ազդեցությունը, դրանով իսկ բարձրացնելով ցերեկային ջերմաստիճանը *Hypericum perforatum*-ի բնական միջավայրում, ինչը նույնպես նպաստում է հիպերիցինի արտադրության աճին: Այս տվյալների հիման վրա այս ուսումնասիրությունը ուսումնասիրել է երկաթի նանոմասնիկների դերը որպես հյուսվածքային կուլտուրայի պոտենցիալ ինդուկտորներ: Արդյունքները ցույց են տվել, որ այս նանոմասնիկները կարող են ակտիվացնել հեսպերիդինի կենսասինթեզին մասնակցող գեները ֆերմենտատիվ խթանման միջոցով, ինչը հանգեցնում է այս միացության կուտակման աճի (Նկար 2): Հետևաբար, բնական պայմաններում աճող բույսերի համեմատ, կարելի է պնդել, որ նման միացությունների արտադրությունը in vivo կարող է նաև բարելավվել, երբ չափավոր սթրեսը համակցվում է երկրորդային մետաբոլիտների կենսասինթեզին մասնակցող գեների ակտիվացման հետ: Համակցված բուժումները, որպես կանոն, դրական ազդեցություն ունեն վերականգնման արագության վրա, բայց որոշ դեպքերում այս ազդեցությունը թուլանում է: Հատկանշական է, որ 1 մգ/լ 2,4-D, 1.5 մգ/լ կինազով և տարբեր կոնցենտրացիաներով բուժումը կարող է անկախ և զգալիորեն մեծացնել վերականգնման արագությունը 50.85%-ով՝ համեմատած վերահսկիչ խմբի հետ (Նկար 4գ): Այս արդյունքները ենթադրում են, որ նանոհորմոնների որոշակի համակցությունները կարող են սիներգիստորեն գործել՝ խթանելով բույսերի աճը և մետաբոլիտների արտադրությունը, ինչը մեծ նշանակություն ունի բուժիչ բույսերի հյուսվածքային կուլտուրայի համար: Պալմերը և Քելլերը [50] ցույց տվեցին, որ 2,4-D մշակումը կարող է անկախ կերպով առաջացնել կոշտուկի առաջացում St. perforatum-ում, մինչդեռ կինազի ավելացումը զգալիորեն ուժեղացրել է կոշտուկի առաջացումը և վերականգնումը: Այս ազդեցությունը պայմանավորված էր հորմոնալ հավասարակշռության բարելավմամբ և բջիջների բաժանման խթանմամբ: Բալը և այլք [51] պարզեցին, որ Fe₃O₄-NP մշակումը կարող է անկախ կերպով բարելավել հակաօքսիդանտ ֆերմենտների գործառույթը, դրանով իսկ խթանելով արմատների աճը St. perforatum-ում: Fe₃O₄ նանոմասնիկներ պարունակող կուլտուրային միջավայրերը 0.5 մգ/լ, 1 մգ/լ և 1.5 մգ/լ կոնցենտրացիաներով բարելավել են կտավատի բույսերի վերականգնման արագությունը [52]: Կինետինի, 2,4-դիքլորբենզոթիազոլինոնի և Fe₃O₄ նանոմասնիկների օգտագործումը զգալիորեն բարելավել է կոշտուկի և արմատի ձևավորման արագությունը, սակայն անհրաժեշտ է հաշվի առնել այս հորմոնների in vitro վերականգնման համար օգտագործման հնարավոր կողմնակի ազդեցությունները: Օրինակ, 2,4-դիքլորբենզոթիազոլինոնի կամ կինետինի երկարատև կամ բարձր կոնցենտրացիայով օգտագործումը կարող է հանգեցնել սոմատիկ կլոնային տատանումների, օքսիդատիվ սթրեսի, կոշտուկի աննորմալ ձևաբանության կամ ապակենման: Հետևաբար, վերականգնման բարձր արագությունը պարտադիր չէ, որ կանխատեսի գենետիկական կայունությունը: Բոլոր վերականգնված բույսերը պետք է գնահատվեն մոլեկուլային մարկերների (օրինակ՝ RAPD, ISSR, AFLP) կամ ցիտոգենետիկ վերլուծության միջոցով՝ որոշելու դրանց միատարրությունը և նմանությունը in vivo բույսերին [53,54,55]:
Այս ուսումնասիրությունն առաջին անգամ ցույց տվեց, որ բույսերի աճի կարգավորիչների (2,4-D և կինետին) և Fe₃O₄ նանոմասնիկների համակցված օգտագործումը կարող է ուժեղացնել մորֆոգենեզը և հիմնական կենսաակտիվ մետաբոլիտների (ներառյալ հիպերիցին և հիպերոզիդ) կուտակումը *Hypericum perforatum*-ում: Օպտիմալացված մշակման ռեժիմը (1 մգ/լ 2,4-D + 1 մգ/լ կինետին + 4 մգ/լ Fe₃O₄-NPs) ոչ միայն մեծացրել է կոշտուկի առաջացումը, օրգանոգենեզը և երկրորդային մետաբոլիտների արտադրությունը, այլև ցույց է տվել մեղմ խթանիչ ազդեցություն, որը հնարավոր է բարելավել բույսի սթրեսի նկատմամբ դիմադրողականությունը և բուժիչ արժեքը: Նանոտեխնոլոգիայի և բույսերի հյուսվածքների կուլտուրայի համադրությունը կայուն և արդյունավետ հարթակ է ապահովում բուժիչ միացությունների մեծածավալ in vitro արտադրության համար: Այս արդյունքները հիմք են հանդիսանում արդյունաբերական կիրառությունների և մոլեկուլային մեխանիզմների, դեղաչափի օպտիմալացման և գենետիկական ճշգրտության ապագա հետազոտությունների համար, այդպիսով կապելով բուժիչ բույսերի վերաբերյալ հիմնարար հետազոտությունները գործնական կենսատեխնոլոգիայի հետ:
Հրապարակման ժամանակը. Դեկտեմբերի 12-2025