Քանակական գիբբերելինային կենսասենսորը բացահայտում է գիբբերելինների դերը միջհանգույցային սպեցիֆիկացիայի մեջ՝ ընձյուղի գագաթային մերիստեմում։

Բույսերի գագաթային մերիստեմի (SAM) աճը կարևոր է ցողունի ճարտարապետության համար։ Բույսերի հորմոններգիբերելիններ(GA)-ները կարևոր դեր են խաղում բույսերի աճի համակարգման գործում, սակայն դրանց դերը SAM-ում դեռևս վատ է հասկացված։ Այստեղ մենք մշակել ենք GA ազդանշանային ուղու ռացիոնոմետրիկ կենսասենսոր՝ DELLA սպիտակուցը ինժեներական եղանակով մշակելով՝ GA տրանսկրիպցիոն պատասխանում դրա էական կարգավորիչ գործառույթը ճնշելու համար՝ միաժամանակ պահպանելով դրա քայքայումը GA ճանաչման ժամանակ։ Մենք ցույց ենք տալիս, որ այս քայքայման վրա հիմնված կենսասենսորը ճշգրիտ գրանցում է GA մակարդակների և բջջային զգայունության փոփոխությունները զարգացման ընթացքում։ Մենք օգտագործել ենք այս կենսասենսորը՝ SAM-ում GA ազդանշանային ակտիվությունը քարտեզագրելու համար։ Մենք ցույց ենք տալիս, որ բարձր GA ազդանշանները հիմնականում առկա են օրգանների պրիմորդիաների միջև գտնվող բջիջներում, որոնք միջբջջային բջիջների նախորդներն են։ Օգտագործելով ֆունկցիայի ստացման և կորստի մոտեցումներ, մենք նաև ցույց ենք տալիս, որ GA-ն կարգավորում է բջջային բաժանման հարթության կողմնորոշումը՝ հաստատելով միջբջջային հանգույցների կանոնիկ բջջային կազմակերպումը, այդպիսով խթանելով միջբջջային սպեցիֆիկացիան SAM-ում։
Բողբոջի գագաթնակետին տեղակայված ընձյուղի գագաթնակետային մերիստեմը (ԸԸՄ), պարունակում է ցողունային բջիջների խորշ, որոնց ակտիվությունը մոդուլային և իտերատիվ ձևով առաջացնում է կողմնային օրգաններ և ցողունային հանգույցներ բույսի ողջ կյանքի ընթացքում: Այս կրկնվող միավորներից, կամ բույսի հանգույցներից յուրաքանչյուրը ներառում է հանգույցներում միջհանգույցներ և կողմնային օրգաններ, ինչպես նաև տերևների անութներում գտնվող անութային մերիստեմներ1: Բույսի հանգույցների աճը և կազմակերպումը փոխվում են զարգացման ընթացքում: Arabidopsis-ի մոտ միջհանգույցային աճը ճնշվում է վեգետատիվ փուլում, և անութային մերիստեմները մնում են անգործուն վարդակաձև տերևների անութներում: Ծաղկային փուլին անցնելու ընթացքում ԸԸՄ-ը դառնում է ծաղկաբույլի մերիստեմ՝ առաջացնելով երկարավուն միջհանգույցներ և անութային բողբոջներ, ճյուղեր ցողունային տերևների անութներում, իսկ ավելի ուշ՝ անտերև ծաղիկներ2: Չնայած մենք զգալի առաջընթաց ենք գրանցել տերևների, ծաղիկների և ճյուղերի առաջացումը վերահսկող մեխանիզմները հասկանալու գործում, համեմատաբար քիչ բան է հայտնի այն մասին, թե ինչպես են առաջանում միջհանգույցները:
GA-ների տարածաժամանակային բաշխման հասկացումը կօգնի ավելի լավ հասկանալ այս հորմոնների գործառույթները տարբեր հյուսվածքներում և զարգացման տարբեր փուլերում: RGA-GFP միաձուլման քայքայման վիզուալիզացիան, որն արտահայտվում է իր սեփական պրոմոտորի ազդեցությամբ, կարևոր տեղեկատվություն է տրամադրում արմատներում GA ընդհանուր մակարդակների կարգավորման վերաբերյալ15,16: Այնուամենայնիվ, RGA արտահայտությունը տարբերվում է հյուսվածքներում17 և կարգավորվում է GA18-ով: Այսպիսով, RGA պրոմոտորի դիֆերենցիալ արտահայտությունը կարող է հանգեցնել RGA-GFP-ի հետ դիտարկվող ֆլուորեսցենցիայի պատկերի, ուստի այս մեթոդը քանակական չէ: Վերջերս, կենսաակտիվ ֆլուորեսցեինով (Fl) նշագրված GA19,20-ը բացահայտեց GA-ի կուտակումը արմատի էնդոկորտեքսում և դրա բջջային մակարդակների կարգավորումը GA տրանսպորտի միջոցով: Վերջերս, GA FRET սենսորը nlsGPS1 ցույց տվեց, որ GA մակարդակները համընկնում են արմատներում, թելիկներում և մուգ աճեցված հիպոկոտիլներում բջիջների երկարացման հետ21: Այնուամենայնիվ, ինչպես տեսանք, GA կոնցենտրացիան GA ազդանշանային ակտիվությունը վերահսկող միակ պարամետրը չէ, քանի որ այն կախված է բարդ զգայուն գործընթացներից: Այստեղ, հիմնվելով DELLA և GA ազդանշանային ուղիների մեր ըմբռնման վրա, մենք ներկայացնում ենք GA ազդանշանային ուղու քայքայման վրա հիմնված ռատիոմետրիկ կենսասենսորի մշակման և բնութագրման մասին: Այս քանակական կենսասենսորը մշակելու համար մենք օգտագործել ենք մուտանտ GA-զգայուն RGA, որը միացված էր ֆլուորեսցենտային սպիտակուցին և ամենուրեք արտահայտվում էր հյուսվածքներում, ինչպես նաև GA-ի նկատմամբ անզգայուն ֆլուորեսցենտային սպիտակուց: Մենք ցույց ենք տալիս, որ մուտանտ RGA սպիտակուցի միաձուլումները չեն խանգարում էնդոգեն GA ազդանշանային ուղուն, երբ այն ամենուրեք արտահայտվում է, և որ այս կենսասենսորը կարող է քանակականացնել ազդանշանային ակտիվությունը, որը առաջանում է ինչպես GA մուտքային, այնպես էլ GA ազդանշանի մշակումից զգայուն սարքի կողմից՝ բարձր տարածաժամանակային լուծաչափով: Մենք օգտագործել ենք այս կենսասենսորը՝ GA ազդանշանային ակտիվության տարածաժամանակային բաշխումը քարտեզագրելու և քանակականացնելու համար, թե ինչպես է GA-ն կարգավորում բջջային վարքագիծը SAM էպիդերմիսում: Մենք ցույց ենք տալիս, որ GA-ն կարգավորում է օրգանների պրիմորդիաների միջև տեղակայված SAM բջիջների բաժանման հարթության կողմնորոշումը, այդպիսով սահմանելով միջհանգույցի կանոնիկ բջջային կազմակերպումը:
Վերջապես, մենք հարցրեցինք, թե արդյոք qmRGA-ն կարող է հաղորդել էնդոգեն GA մակարդակների փոփոխությունների մասին՝ օգտագործելով աճող հիպոկոտիլներ: Մենք նախկինում ցույց ենք տվել, որ նիտրատը խթանում է աճը՝ մեծացնելով GA սինթեզը և, իր հերթին, DELLA34 քայքայումը: Համապատասխանաբար, մենք նկատել ենք, որ pUBQ10::qmRGA սածիլների հիպոկոտիլի երկարությունը, որոնք աճեցվել են նիտրատի առատ մատակարարման (10 մՄ NO3−) տակ, զգալիորեն ավելի երկար էր, քան նիտրատի անբավարարության պայմաններում աճեցված սածիլների մոտ (Լրացուցիչ նկ. 6ա): Աճի արձագանքին համապատասխան, GA ազդանշանները ավելի բարձր էին 10 մՄ NO3− պայմաններում աճեցված սածիլների հիպոկոտիլներում, քան նիտրատի բացակայության դեպքում աճեցված սածիլներում (Լրացուցիչ նկ. 6բ, գ): Այսպիսով, qmRGA-ն նաև հնարավորություն է տալիս վերահսկել GA ազդանշանային փոփոխությունների փոփոխությունները, որոնք առաջացել են GA կոնցենտրացիայի էնդոգեն փոփոխություններից:
Հասկանալու համար, թե արդյոք qmRGA-ի կողմից հայտնաբերված GA ազդանշանային ակտիվությունը կախված է GA կոնցենտրացիայից և GA ընկալումից, ինչպես և սպասվում էր սենսորի դիզայնի հիման վրա, մենք վերլուծեցինք երեք GID1 ընկալիչների արտահայտությունը վեգետատիվ և վերարտադրողական հյուսվածքներում: Սածիլներում GID1-GUS ռեպորտերային գիծը ցույց տվեց, որ GID1a-ն և c-ն բարձր արտահայտված էին կոտիլեդոններում (Նկար 3a-c): Բացի այդ, բոլոր երեք ընկալիչներն էլ արտահայտված էին տերևներում, կողմնային արմատային պրիմորդիումներում, արմատների ծայրերում (բացառությամբ GID1b-ի արմատային գլխարկի) և անոթային համակարգում (Նկար 3a-c): SAM ծաղկաբույլում մենք GUS ազդանշաններ հայտնաբերեցինք միայն GID1b-ի և 1c-ի համար (Լրացուցիչ Նկ. 7a-c): In situ հիբրիդացումը հաստատեց այս արտահայտման օրինաչափությունները և հետագայում ցույց տվեց, որ GID1c-ն միատարր արտահայտվում էր SAM-ի ցածր մակարդակներում, մինչդեռ GID1b-ն ավելի բարձր արտահայտվածություն էր ցուցաբերում SAM-ի ծայրամասում (Լրացուցիչ Նկ. 7d-l): pGID1b::2xmTQ2-GID1b թարգմանչական միաձուլումը նաև բացահայտեց GID1b արտահայտման աստիճանական միջակայք՝ SAM-ի կենտրոնում ցածր կամ ընդհանրապես արտահայտված լինելուց մինչև օրգանների սահմաններում բարձր արտահայտվածություն (Լրացուցիչ նկ. 7մ): Այսպիսով, GID1 ընկալիչները միատարր չեն բաշխվում հյուսվածքների վրա և ներսում: Հետագա փորձերի ժամանակ մենք նաև նկատեցինք, որ GID1-ի (pUBQ10::GID1a-mCherry) գերարտահայտումը մեծացրել է qmRGA-ի զգայունությունը հիպոկոտիլներում արտաքին GA կիրառման նկատմամբ (Նկ. 3դ, ե): Ի տարբերություն դրա, հիպոկոտիլում qd17mRGA-ով չափված ֆլուորեսցենցիան անզգայուն էր GA3 մշակման նկատմամբ (Նկ. 3ֆ, գ): Երկու փորձարկումների համար էլ սածիլները մշակվել են GA-ի բարձր կոնցենտրացիաներով (100 մկՄ GA3)՝ սենսորի արագ վարքագիծը գնահատելու համար, որտեղ GID1 ընկալիչին կապվելու ունակությունը ուժեղացել կամ կորել է: Այս արդյունքները միասին հաստատում են, որ qmRGA կենսասենսորը կատարում է GA և GA սենսորների համակցված գործառույթ և ենթադրում են, որ GID1 ընկալիչի դիֆերենցիալ էքսպրեսիան կարող է զգալիորեն մոդուլացնել սենսորի ճառագայթման ունակությունը։
Մինչ օրս, GA ազդանշանների բաշխումը SAM-ում մնում է անհասկանալի: Հետևաբար, մենք օգտագործել ենք qmRGA արտահայտող բույսեր և pCLV3::mCherry-NLS ցողունային բջիջների ռեպորտեր35՝ GA ազդանշանային ակտիվության բարձր թույլտվությամբ քանակական քարտեզները հաշվարկելու համար, կենտրոնանալով L1 շերտի վրա (էպիդերմիս; Նկ. 4ա, բ, տե՛ս մեթոդներ և լրացուցիչ մեթոդներ), քանի որ L1-ը կարևոր դեր է խաղում SAM աճի վերահսկման գործում36: Այստեղ pCLV3::mCherry-NLS արտահայտությունը ապահովել է ֆիքսված երկրաչափական հենակետ GA ազդանշանային ակտիվության տարածաժամանակային բաշխումը վերլուծելու համար37: Չնայած GA-ն համարվում է էական կողմնային օրգանների զարգացման համար4, մենք նկատել ենք, որ GA ազդանշանները ցածր էին ծաղկային պրիմորդիումում (P)՝ սկսած P3 փուլից (Նկ. 4ա, բ), մինչդեռ երիտասարդ P1 և P2 պրիմորդիումներն ունեին միջին ակտիվություն, որը նման էր կենտրոնական շրջանում ակտիվությանը (Նկ. 4ա, բ): Ավելի բարձր GA ազդանշանային ակտիվություն է հայտնաբերվել օրգանի պրիմորդիումի սահմաններում՝ սկսած P1/P2-ից (սահմանի կողմերում) և գագաթնակետին հասնելով P4-ում, ինչպես նաև պրիմորդիումների միջև գտնվող ծայրամասային շրջանի բոլոր բջիջներում (Նկար 4ա, բ և լրացուցիչ նկար 8ա, բ): Այս ավելի բարձր GA ազդանշանային ակտիվությունը դիտվել է ոչ միայն էպիդերմիսում, այլև L2 և վերին L3 շերտերում (Լրացուցիչ նկար 8բ): qmRGA-ի միջոցով SAM-ում հայտնաբերված GA ազդանշանների պատկերը նույնպես ժամանակի ընթացքում մնացել է անփոփոխ (Լրացուցիչ նկար 8գ-ֆ, կ): Չնայած qd17mRGA կառուցվածքը համակարգված կերպով իջեցվել է T3 բույսերի SAM-ում՝ հինգ անկախ գծերից, որոնք մենք մանրամասն բնութագրել ենք, մենք կարողացանք վերլուծել pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP կառուցվածքով ստացված ֆլուորեսցենցիայի պատկերները (Լրացուցիչ նկար 8գ-ջ, լ): Այս վերահսկիչ գծում SAM-ում հայտնաբերվել են միայն ֆլուորեսցենցիայի հարաբերակցության աննշան փոփոխություններ, սակայն SAM կենտրոնում մենք դիտարկել ենք TagBFP-ի հետ կապված VENUS-ի հստակ և անսպասելի նվազում: Սա հաստատում է, որ qmRGA-ի կողմից դիտարկվող ազդանշանային օրինաչափությունը արտացոլում է mRGA-VENUS-ի GA-կախյալ քայքայումը, բայց նաև ցույց է տալիս, որ qmRGA-ն կարող է գերագնահատել GA ազդանշանային ակտիվությունը մերիստեմային կենտրոնում: Ամփոփելով՝ մեր արդյունքները բացահայտում են GA ազդանշանային օրինաչափություն, որը հիմնականում արտացոլում է պրիմորդիումների բաշխումը: Միջպրիմորդիալ շրջանի (IPR) այս բաշխումը պայմանավորված է զարգացող պրիմորդիումի և կենտրոնական շրջանի միջև GA ազդանշանային բարձր ակտիվության աստիճանական հաստատմամբ, մինչդեռ միևնույն ժամանակ պրիմորդիումում GA ազդանշանային ակտիվությունը նվազում է (Նկար 4c, d):
GID1b և GID1c ընկալիչների բաշխումը (տե՛ս վերևում) ենթադրում է, որ GA ընկալիչների դիֆերենցիալ արտահայտումը նպաստում է SAM-ում GA ազդանշանային ակտիվության օրինաչափության ձևավորմանը: Մենք հետաքրքրվեցինք, թե արդյոք GA-ի դիֆերենցիալ կուտակումը կարող է ներգրավված լինել: Այս հնարավորությունը ուսումնասիրելու համար մենք օգտագործեցինք nlsGPS1 GA FRET սենսորը21: 10 մկՄ GA4+7-ով 100 րոպե մշակված nlsGPS1-ի SAM-ում (Լրացուցիչ նկ. 9a-e), հայտնաբերվել է ակտիվացման հաճախականության աճ, ինչը ցույց է տալիս, որ nlsGPS1-ը արձագանքում է SAM-ում GA կոնցենտրացիայի փոփոխություններին, ինչպես դա անում է արմատներում21: NlsGPS1 ակտիվացման հաճախականության տարածական բաշխումը ցույց է տվել GA-ի համեմատաբար ցածր մակարդակներ SAM-ի արտաքին շերտերում, բայց ցույց է տվել, որ դրանք բարձրացված են կենտրոնում և SAM-ի սահմաններում (Նկ. 4e և Լրացուցիչ նկ. 9a,c): Սա ենթադրում է, որ GA-ն նույնպես տարածված է SAM-ում՝ տարածական օրինաչափությամբ, որը համեմատելի է qmRGA-ի կողմից բացահայտվածի հետ: Որպես լրացուցիչ մոտեցում, մենք նաև SAM-ը մշակել ենք ֆլուորեսցենտային GA-ով (GA3-, GA4-, GA7-Fl) կամ միայն Fl-ով՝ որպես բացասական վերահսկողություն: Fl ազդանշանը բաշխվել է SAM-ի ամբողջ տարածքում, ներառյալ կենտրոնական շրջանը և պրիմորդիումը, թեև ավելի ցածր ինտենսիվությամբ (Նկար 4j և լրացուցիչ նկար 10d): Ի տարբերություն դրա, բոլոր երեք GA-Fl-ները կուտակվել են հատուկ պրիմորդիումի սահմաններում և տարբեր աստիճաններով IPR-ի մնացած մասում, որտեղ GA7-Fl-ը կուտակվել է IPR-ի ամենամեծ տիրույթում (Նկար 4k և լրացուցիչ նկար 10a,b): Ֆլուորեսցենցիայի ինտենսիվության քանակական որոշումը ցույց է տվել, որ IPR-ի և ոչ IPR ինտենսիվության հարաբերակցությունն ավելի բարձր էր GA-Fl-ով մշակված SAM-ում՝ համեմատած Fl-ով մշակված SAM-ի հետ (Նկար 4l և լրացուցիչ նկար 10c): Այս արդյունքները միասին ենթադրում են, որ GA-ն առկա է ավելի բարձր կոնցենտրացիաներով օրգանների սահմանին ամենամոտ գտնվող IPR բջիջներում: Սա ենթադրում է, որ SAM GA ազդանշանային ակտիվության օրինաչափությունը պայմանավորված է ինչպես GA ընկալիչների դիֆերենցիալ արտահայտմամբ, այնպես էլ GA-ի դիֆերենցիալ կուտակմամբ օրգանների սահմանների մոտ գտնվող IPR բջիջներում: Այսպիսով, մեր վերլուծությունը բացահայտեց GA ազդանշանային ուղու անսպասելի տարածաժամանակային օրինաչափություն՝ SAM-ի կենտրոնում և նախամուտքում ավելի ցածր ակտիվությամբ և IPR-ի ավելի բարձր ակտիվությամբ ծայրամասային շրջանում:
SAM-ում GA-ի դիֆերենցիալ ազդանշանային ակտիվության դերը հասկանալու համար մենք վերլուծեցինք GA ազդանշանային ակտիվության, բջջային ընդլայնման և բջջային բաժանման միջև եղած կապը՝ օգտագործելով SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS-ի իրական ժամանակի ժամանակային պատկերումը: Հաշվի առնելով GA-ի դերը աճի կարգավորման մեջ, ակնկալվում էր դրական կապ բջիջների ընդլայնման պարամետրերի հետ: Հետևաբար, մենք նախ համեմատեցինք GA ազդանշանային ակտիվության քարտեզները բջջային մակերեսի աճի տեմպի քարտեզների հետ (որպես տվյալ բջջի և դուստր բջիջների բաժանման պահին բջջային ընդլայնման ուժի փոխարինող) և աճի անիզոտրոպիայի քարտեզների հետ, որոնք չափում են բջջային ընդլայնման ուղղությունը (այստեղ նույնպես օգտագործվում է տվյալ բջջի և դուստր բջիջների բաժանման պահին. Նկար 5ա,բ, տե՛ս մեթոդներ և լրացուցիչ մեթոդներ): SAM բջջային մակերեսի աճի տեմպի մեր քարտեզները համապատասխանում են նախորդ դիտարկումներին38,39՝ սահմանին նվազագույն աճի տեմպերով և զարգացող ծաղիկների առավելագույն աճի տեմպերով (Նկար 5ա): Գլխավոր բաղադրիչների վերլուծությունը (ԳԿՎ) ցույց տվեց, որ GA ազդանշանային ակտիվությունը բացասաբար էր կապված բջջային մակերեսի աճի ինտենսիվության հետ (Նկար 5գ): Մենք նաև ցույց տվեցինք, որ տատանման հիմնական առանցքները, ներառյալ GA ազդանշանային մուտքը և աճի ինտենսիվությունը, օրթոգոնալ էին CLV3-ի բարձր արտահայտությամբ որոշված ​​ուղղության նկատմամբ, ինչը հաստատում է բջիջների բացառումը SAM կենտրոնից մնացած վերլուծություններում: Սփիրմանի կորելյացիոն վերլուծությունը հաստատեց PCA արդյունքները (Նկար 5դ), ցույց տալով, որ IPR-ում GA ազդանշանների ավելի բարձր մակարդակը չի հանգեցրել բջիջների ավելի բարձր ընդլայնման: Այնուամենայնիվ, կորելյացիոն վերլուծությունը բացահայտեց GA ազդանշանային ակտիվության և աճի անիզոտրոպիայի միջև աննշան դրական կորելյացիա (Նկար 5գ, դ), ինչը ենթադրում է, որ IPR-ում GA ազդանշանների ավելի բարձր մակարդակը ազդում է բջիջների աճի ուղղության և, հնարավոր է, բջջային բաժանման հարթության դիրքի վրա:
ա, բ SAM-ում միջին մակերեսային աճի (ա) և աճի անիզոտրոպիայի (բ) ջերմային քարտեզները միջինացված են յոթ անկախ բույսերի համար (համապատասխանաբար օգտագործվել են որպես բջիջների ընդլայնման ուժի և ուղղության փոփոխականներ): գ PCA վերլուծությունը ներառել է հետևյալ փոփոխականները՝ GA ազդանշան, մակերեսային աճի ինտենսիվություն, մակերեսային աճի անիզոտրոպիա և CLV3 արտահայտություն: PCA բաղադրիչ 1-ը հիմնականում բացասականորեն կապված էր մակերեսային աճի ինտենսիվության հետ և դրականորեն կապված էր GA ազդանշանի հետ: PCA բաղադրիչ 2-ը հիմնականում դրականորեն կապված էր մակերեսային աճի անիզոտրոպիայի հետ և բացասականորեն կապված էր CLV3 արտահայտության հետ: Տոկոսները ներկայացնում են յուրաքանչյուր բաղադրիչով բացատրվող տատանումը: դ Սփիրմանի կոռելյացիոն վերլուծություն GA ազդանշանի, մակերեսային աճի ինտենսիվության և մակերեսային աճի անիզոտրոպիայի միջև հյուսվածքային մասշտաբով՝ բացառությամբ CZ-ի: Աջ կողմում գտնվող թիվը երկու փոփոխականների միջև Սփիրմանի rho արժեքն է: Աստղանիշները ցույց են տալիս այն դեպքերը, երբ կոռելյացիան/բացասական կոռելյացիան խիստ նշանակալի է: ե Col-0 SAM L1 բջիջների եռաչափ վիզուալիզացիա կոնֆոկալ մանրադիտակով: SAM-ում (բայց ոչ պրիմորդիումում) 10 ժամ անց ձևավորված նոր բջջային պատերը գունավորվում են իրենց անկյունային արժեքներին համապատասխան: Գունային սյունը ցույց է տրված ներքևի աջ անկյունում: Ներդիրը ցույց է տալիս համապատասխան եռաչափ պատկերը 0 ժամ անց: Փորձը կրկնվել է երկու անգամ՝ նմանատիպ արդյունքներով: f Տուփերի գրաֆիկները ցույց են տալիս բջիջների բաժանման արագությունները IPR և ոչ IPR Col-0 SAM-ում (n = 10 անկախ բույսեր): Կենտրոնական գիծը ցույց է տալիս միջնարժեքը, իսկ տուփի սահմանները՝ 25-րդ և 75-րդ պերսենտիլները: Բեղիկները ցույց են տալիս R ծրագրաշարով որոշված ​​նվազագույն և առավելագույն արժեքները: P արժեքները ստացվել են Ուելչի երկկողմանի t-թեստով: g, h Սխեմատիկ դիագրամ, որը ցույց է տալիս (g) նոր բջջային պատի (մանուշակագույն) անկյունը SAM-ի կենտրոնից ճառագայթային ուղղությամբ (սպիտակ կետավոր գիծ) չափելու եղանակը (հաշվի են առնվում միայն սուր անկյան արժեքները, այսինքն՝ 0–90°), և (h) մերիստեմի ներսում շրջանաձև/կողային և ճառագայթային ուղղությունները: i Բջջային բաժանման հարթության կողմնորոշման հաճախականության հիստոգրամներ SAM-ի (մուգ կապույտ), IPR-ի (միջին կապույտ) և ոչ-IPR-ի (բաց կապույտ) վրա համապատասխանաբար: P արժեքները ստացվել են երկկողմանի Կոլմոգորով-Սմիրնովի թեստով: Փորձը կրկնվել է երկու անգամ՝ նմանատիպ արդյունքներով: j Բջջային բաժանման հարթության կողմնորոշման հաճախականության հիստոգրամներ IPR-ի շուրջ համապատասխանաբար P3-ի (բաց կանաչ), P4-ի (միջին կանաչ) և P5-ի (մուգ կանաչ) շուրջ: P արժեքները ստացվել են երկկողմանի Կոլմոգորով-Սմիրնովի թեստով: Փորձը կրկնվել է երկու անգամ՝ նմանատիպ արդյունքներով:
Հետևաբար, մենք հաջորդիվ ուսումնասիրեցինք GA ազդանշանային ուղու և բջջային բաժանման ակտիվության միջև եղած փոխհարաբերությունը՝ փորձարկման ընթացքում նույնականացնելով նոր ձևավորված բջջային պատերը (Նկար 5ե): Այս մոտեցումը թույլ տվեց մեզ չափել բջջային բաժանման հաճախականությունը և ուղղությունը: Հետաքրքիր է, որ մենք պարզեցինք, որ բջջային բաժանումների հաճախականությունը IPR-ում և SAM-ի մնացած մասում (ոչ-IPR, Նկար 5ե), նման էր, ինչը ցույց է տալիս, որ GA ազդանշանային ուղու տարբերությունները IPR և ոչ-IPR բջիջների միջև էականորեն չեն ազդում բջջային բաժանման վրա: Սա, ինչպես նաև GA ազդանշանային ուղու և աճի անիզոտրոպիայի միջև դրական փոխհարաբերությունը մեզ դրդեցին մտածել, թե արդյոք GA ազդանշանային ակտիվությունը կարող է ազդել բջջային բաժանման հարթության կողմնորոշման վրա: Մենք չափեցինք նոր բջջային պատի կողմնորոշումը որպես սուր անկյուն մերիստեմի կենտրոնը և նոր բջջային պատի կենտրոնը միացնող ճառագայթային առանցքի նկատմամբ (Նկար 5e-i) և դիտարկեցինք բջիջների հստակ միտում՝ բաժանվելու ճառագայթային առանցքի նկատմամբ 90°-ին մոտ անկյան տակ, որտեղ ամենաբարձր հաճախականությունները դիտվել են 70–80° (23.28%) և 80–90° (22.62%) անկյուններում (Նկար 5e,i), որոնք համապատասխանում են բջջային բաժանումներին շրջանագծային/լայնակի ուղղությամբ (Նկար 5h): Այս բջջային բաժանման վարքագծին GA ազդանշանային ուղու ներդրումը ուսումնասիրելու համար մենք առանձին վերլուծեցինք բջջային բաժանման պարամետրերը IPR-ում և ոչ-IPR-ում (Նկար 5i): Մենք նկատեցինք, որ IPR բջիջներում բաժանման անկյան բաշխումը տարբերվում էր ոչ-IPR բջիջներից կամ ամբողջ SAM-ի բջիջներից, որտեղ IPR բջիջները ցուցաբերում էին կողմնային/շրջանաձև բջջային բաժանումների ավելի բարձր համամասնություն, այսինքն՝ 70–80° և 80–90° (համապատասխանաբար 33.86% և 30.71% համապատասխան համամասնություններ) (Նկար 5i): Այսպիսով, մեր դիտարկումները բացահայտեցին կապ բարձր GA ազդանշանային ուղու և բջջային բաժանման հարթության կողմնորոշման միջև, որը մոտ է շրջագծային ուղղությանը, նման է GA ազդանշանային ակտիվության և աճի անիզոտրոպիայի միջև փոխհարաբերությանը (Նկար 5c, d): Այս կապի տարածական պահպանումը ավելի լավ հաստատելու համար մենք չափեցինք բաժանման հարթության կողմնորոշումը պրիմորդիումը շրջապատող IPR բջիջներում՝ սկսած P3-ից, քանի որ ամենաբարձր GA ազդանշանային ակտիվությունը հայտնաբերվել է այս շրջանում՝ սկսած P4-ից (Նկար 4): P3-ի և P4-ի շուրջ IPR-ի բաժանման անկյունները վիճակագրորեն նշանակալի տարբերություններ չցուցաբերեցին, չնայած P4-ի շուրջ IPR-ում դիտվել է կողմնային բջջային բաժանումների հաճախականության աճ (Նկար 5j): Սակայն, P5-ի շուրջ գտնվող IPR բջիջներում բջջային բաժանման հարթության կողմնորոշման տարբերությունը դարձավ վիճակագրորեն նշանակալի՝ լայնակի բջջային բաժանումների հաճախականության կտրուկ աճով (Նկ. 5j): Այս արդյունքները միասին ենթադրում են, որ GA ազդանշանային ուղին կարող է վերահսկել բջջային բաժանումների կողմնորոշումը SAM-ում, ինչը համապատասխանում է նախորդ հաղորդագրությունների40,41 հետ, որ բարձր GA ազդանշանային ուղին կարող է առաջացնել բջջային բաժանումների կողմնային կողմնորոշում IPR-ում:
Կանխատեսվում է, որ ներբջջային հանգույցի բջիջները չեն ներառվի պրիմորդիումներում, այլ միջհանգույցներում2,42,43: ներբջջային հանգույցում բջջային բաժանումների լայնակի կողմնորոշումը կարող է հանգեցնել միջհանգույցներում էպիդերմալ բջիջների զուգահեռ երկայնական շարքերի բնորոշ կազմակերպմանը: Վերը նկարագրված մեր դիտարկումները ենթադրում են, որ GA ազդանշանային ուղին, հավանաբար, դեր է խաղում այս գործընթացում՝ կարգավորելով բջջային բաժանման ուղղությունը:
Մի քանի DELLA գեների ֆունկցիայի կորուստը հանգեցնում է կոնստիտուցիոնալ GA արձագանքի, և della մուտանտները կարող են օգտագործվել այս վարկածը ստուգելու համար44: Մենք նախ վերլուծեցինք SAM-ում հինգ DELLA գեների արտահայտման օրինաչափությունները: GUS գծի տրանսկրիպցիոն միաձուլումը45 ցույց տվեց, որ GAI, RGA, RGL1 և RGL2 (շատ ավելի փոքր չափով) արտահայտվել են SAM-ում (Լրացուցիչ նկ. 11a-d): In situ հիբրիդացումը հետագայում ցույց տվեց, որ GAI mRNA-ն կուտակվում է հատուկ պրիմորդիաներում և զարգացող ծաղիկներում (Լրացուցիչ նկ. 11e): RGL1 և RGL3 mRNA-ն հայտնաբերվել է SAM-ի ամբողջ սաղարթում և ավելի հին ծաղիկներում, մինչդեռ RGL2 mRNA-ն ավելի առատ էր սահմանային շրջանում (Լրացուցիչ նկ. 11f-h): pRGL3::RGL3-GFP SAM-ի կոնֆոկալ պատկերումը հաստատեց in situ հիբրիդացման միջոցով դիտարկված արտահայտությունը և ցույց տվեց, որ RGL3 սպիտակուցը կուտակվում է SAM-ի կենտրոնական մասում (Լրացուցիչ նկ. 11i): pRGA::GFP-RGA գիծը օգտագործելով՝ մենք նաև պարզեցինք, որ RGA սպիտակուցը կուտակվում է SAM-ում, սակայն դրա առատությունը նվազում է սահմանին՝ սկսած P4-ից (Լրացուցիչ նկ. 11j): Հատկանշական է, որ RGL3-ի և RGA-ի արտահայտման օրինաչափությունները համապատասխանում են IPR-ում GA ազդանշանային ավելի բարձր ակտիվությանը, ինչպես հայտնաբերվել է qmRGA-ի կողմից (նկ. 4): Ավելին, այս տվյալները ցույց են տալիս, որ բոլոր DELLA-ները արտահայտվում են SAM-ում, և որ դրանց արտահայտությունը միասին տարածվում է ամբողջ SAM-ի վրա:
Հաջորդը մենք վերլուծեցինք բջջային բաժանման պարամետրերը վայրի տիպի SAM-ում (Ler, վերահսկիչ) և gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della հնգյակի (գլոբալ) մուտանտներում (Նկար 6ա, բ): Հետաքրքիր է, որ մենք դիտարկեցինք բջջային բաժանման անկյունների հաճախականությունների բաշխման վիճակագրորեն նշանակալի տեղաշարժ della global մուտանտ SAM-ում՝ վայրի տիպի համեմատ (Նկար 6գ): Della global մուտանտի այս փոփոխությունը պայմանավորված էր 80–90° անկյունների հաճախականության աճով (34.71% ընդդեմ 24.55%) և, ավելի փոքր չափով, 70–80° անկյուններով (23.78% ընդդեմ 20.18%), այսինքն՝ համապատասխանում էր լայնակի բջջային բաժանումներին (Նկար 6գ): Ոչ լայնակի բաժանումների հաճախականությունը (0–60°) նույնպես ցածր էր della global մուտանտի մոտ (Նկար 6գ): Դելլա գլոբալ մուտանտի SAM-ում լայնակի բջջային բաժանումների հաճախականությունը զգալիորեն մեծացել էր (Նկար 6բ): IPR-ում լայնակի բջջային բաժանումների հաճախականությունը նույնպես ավելի բարձր էր դելլա գլոբալ մուտանտի մոտ՝ վայրի տիպի համեմատ (Նկար 6դ): IPR շրջանից դուրս վայրի տեսակն ուներ բջջային բաժանման անկյունների ավելի միատարր բաշխում, մինչդեռ դելլա գլոբալ մուտանտը նախընտրում էր շոշափողական բաժանումներ, ինչպես IPR-ը (Նկար 6ե): Մենք նաև քանակապես որոշեցինք բջջային բաժանումների կողմնորոշումը ga2 օքսիդազի (ga2ox) հնգակի մուտանտների (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1 և ga2ox6-2) SAM-ում, որը GA-ոչ ակտիվ մուտանտային ֆոն է, որտեղ կուտակվում է GA-ն: Համապատասխանաբար GA մակարդակների աճին, հնգակի ga2ox մուտանտի ծաղկաբույլի SAM-ը ավելի մեծ էր, քան Col-0-ինը (Լրացուցիչ Նկ. 12a, b), և Col-0-ի համեմատ հնգակի ga2ox SAM-ը ցույց տվեց բջջային բաժանման անկյունների հստակ տարբեր բաշխում, որտեղ անկյունային հաճախականությունը մեծանում էր 50°-ից մինչև 90°, այսինքն՝ կրկին նպաստելով շոշափող բաժանումներին (Լրացուցիչ Նկ. 12a-c): Այսպիսով, մենք ցույց ենք տալիս, որ GA ազդանշանային ուղու կոնստիտուցիոնալ ակտիվացումը և GA կուտակումը առաջացնում են կողմնային բջջային բաժանումներ IPR-ում և SAM-ի մնացած մասում:
a, b PI-ով ներկված Ler (a)-ի L1 շերտի և գլոբալ դելլա մուտանտի (b) SAM-ի L1 շերտի եռաչափ վիզուալիզացիա՝ կոնֆոկալ մանրադիտակի միջոցով: SAM-ում (բայց ոչ պրիմորդիումում) 10 ժամվա ընթացքում ձևավորված նոր բջջային պատերը ցույց են տրված և գունավորված են իրենց անկյունային արժեքներին համապատասխան: Ներդիրը ցույց է տալիս SAM-ը 0 ժամում: Գունային գոտին ցուցադրվում է ներքևի աջ անկյունում: (b)-ում նետը ցույց է տալիս գլոբալ դելլա մուտանտի համընկնող բջջային ֆայլերի օրինակ: Փորձը կրկնվել է երկու անգամ՝ նմանատիպ արդյունքներով: ce բջջային բաժանման հարթության կողմնորոշումների հաճախականության բաշխման համեմատություն ամբողջ SAM-ում (d), IPR (e) և ոչ-IPR (f)-ում Ler-ի և գլոբալ դելլայի միջև: P արժեքները ստացվել են երկկողմանի Կոլմոգորով-Սմիրնովի թեստի միջոցով: f, g Col-0 (i) և pCUC2::gai-1-VENUS (j) տրանսգենային բույսերի PI-ով ներկված SAM-ի կոնֆոկալ պատկերների եռաչափ վիզուալիզացիա: (a, b) վահանակները ցույց են տալիս SAM-ում 10 ժամվա ընթացքում ձևավորված նոր բջջային պատեր (բայց ոչ պրիմորդիաներ): Փորձը կրկնվել է երկու անգամ՝ նմանատիպ արդյունքներով: h–j Բջջային բաժանման հարթության կողմնորոշումների հաճախականության բաշխման համեմատություն ամբողջ SAM-ում (h), IPR (i) և ոչ-IPR (j) տեղակայված Col-0 և pCUC2::gai-1-VENUS բույսերի միջև: P արժեքները ստացվել են երկկողմանի Կոլմոգորով-Սմիրնովի թեստի միջոցով:
Հաջորդը մենք փորձարկեցինք GA ազդանշանային ուղու արգելակման ազդեցությունը հատկապես IPR-ում: Այդ նպատակով մենք օգտագործեցինք cotyledon cup 2 (CUC2) պրոմոտորը՝ VENUS-ին միացված գերիշխող բացասական gai-1 սպիտակուցի (pCUC2::gai-1-VENUS գծում) արտահայտությունը խթանելու համար: Վայրի տիպի SAM-ում CUC2 պրոմոտորը խթանում է SAM-ում IPR-ների մեծ մասի արտահայտությունը, ներառյալ սահմանային բջիջները, P4-ից սկսած, և նմանատիպ յուրահատուկ արտահայտություն դիտվել է pCUC2::gai-1-VENUS բույսերում (տե՛ս ստորև): pCUC2::gai-1-VENUS բույսերի SAM-ի կամ IPR-ի վրա բջջային բաժանման անկյունների բաշխումը էականորեն չէր տարբերվում վայրի տիպից, չնայած անսպասելիորեն մենք հայտնաբերեցինք, որ այս բույսերում IPR չունեցող բջիջները բաժանվում էին ավելի բարձր՝ 80-90° հաճախականությամբ (Նկար 6f-j):
Առաջարկվել է, որ բջջային բաժանման ուղղությունը կախված է SAM-ի երկրաչափությունից, մասնավորապես՝ հյուսվածքի կորության հետևանքով առաջացած ձգման լարումից46: Հետևաբար, մենք հարցրեցինք, թե արդյոք SAM-ի ձևը փոխվել է della global մուտանտ և pCUC2::gai-1-VENUS բույսերում: Ինչպես նախկինում հաղորդվել է12, della global մուտանտ SAM-ի չափը ավելի մեծ էր, քան վայրի տիպինը (Լրացուցիչ նկ. 13a, b, d): CLV3-ի և STM RNA-ի in situ հիբրիդացումը հաստատեց մերիստեմի ընդլայնումը della մուտանտների մոտ և հետագայում ցույց տվեց ցողունային բջիջների խորշի կողմնային ընդլայնումը (Լրացուցիչ նկ. 13e, f, h, i): Այնուամենայնիվ, SAM-ի կորությունը նման էր երկու գենոտիպերում էլ (Լրացուցիչ նկ. 13k, m, n, p): Մենք դիտարկեցինք չափի նմանատիպ աճ gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della քառակի մուտանտի մոտ՝ առանց կորության փոփոխության՝ վայրի տիպի համեմատ (Լրացուցիչ Նկ. 13c, d, g, j, l, o, p): Բջջային բաժանման կողմնորոշման հաճախականությունը նույնպես ազդվել է della քառակի մուտանտի մոտ, բայց ավելի փոքր չափով, քան della մոնոլիտիկ մուտանտի մոտ (Լրացուցիչ Նկ. 12d-f): Այս դեղաչափի ազդեցությունը, ինչպես նաև կորության վրա ազդեցության բացակայությունը, ենթադրում են, որ Della քառակի մուտանտի մնացորդային RGL3 ակտիվությունը սահմանափակում է DELLA ակտիվության կորստի պատճառով բջիջների բաժանման կողմնորոշման փոփոխությունները, և որ կողմնային բջջային բաժանումների փոփոխությունները տեղի են ունենում GA ազդանշանային ակտիվության փոփոխությունների, այլ ոչ թե SAM երկրաչափության փոփոխությունների ի պատասխան: Ինչպես նկարագրված է վերևում, CUC2 պրոմոտորը խթանում է IPR արտահայտությունը SAM-ում՝ սկսած P4-ից (Լրացուցիչ Նկ. 14a, b), և ի տարբերություն դրա, pCUC2::gai-1-VENUS SAM-ը ուներ փոքրացված չափ, բայց ավելի բարձր կորություն (Լրացուցիչ Նկ. 14c-h): pCUC2::gai-1-VENUS SAM ձևաբանության այս փոփոխությունը կարող է հանգեցնել մեխանիկական լարումների տարբեր բաշխման՝ համեմատած վայրի տիպի հետ, որտեղ բարձր շրջագծային լարումները սկսվում են SAM կենտրոնից ավելի կարճ հեռավորության վրա47: Այլընտրանքորեն, pCUC2::gai-1-VENUS SAM ձևաբանության փոփոխությունները կարող են առաջանալ տրանսգենային արտահայտմամբ պայմանավորված տարածաշրջանային մեխանիկական հատկությունների փոփոխություններից48: Երկու դեպքում էլ սա կարող է մասամբ չեզոքացնել GA ազդանշանային փոփոխությունների ազդեցությունը՝ մեծացնելով բջիջների շրջանագծային/լայնակի կողմնորոշմամբ բաժանման հավանականությունը, ինչը բացատրում է մեր դիտարկումները:
Ամփոփելով՝ մեր տվյալները հաստատում են, որ ավելի բարձր GA ազդանշանային ուղին ակտիվ դեր է խաղում բջջային բաժանման հարթության կողմնային կողմնորոշման մեջ IPR-ում: Դրանք նաև ցույց են տալիս, որ մերիստեմի կորությունը նույնպես ազդում է բջջային բաժանման հարթության կողմնորոշման վրա IPR-ում:
IPR-ում բաժանարար հարթության լայնակի կողմնորոշումը, պայմանավորված GA ազդանշանային բարձր ակտիվությամբ, ենթադրում է, որ GA-ն նախապես կազմակերպում է ճառագայթային բջջային ֆայլ էպիդերմիսում SAM-ի ներսում՝ սահմանելու բջջային կազմակերպումը, որը հետագայում կգտնվի էպիդերմալ միջհանգույցում: Իրոք, նման բջջային ֆայլերը հաճախ տեսանելի էին della global մուտանտների SAM պատկերներում (Նկար 6բ): Այսպիսով, SAM-ում GA ազդանշանային տարածական օրինաչափության զարգացման գործառույթը հետագա ուսումնասիրելու համար մենք օգտագործեցինք ժամանակի ընդհատումային պատկերում՝ վերլուծելու բջիջների տարածական կազմակերպումը IPR-ում վայրի տիպի (Ler և Col-0), della global մուտանտների և pCUC2::gai-1-VENUS տրանսգենային բույսերի մոտ:
Մենք պարզեցինք, որ qmRGA-ն ցույց է տալիս, որ GA ազդանշանային ակտիվությունը IPR-ում աճել է P1/P2-ից և հասել է գագաթնակետին P4-ում, և այս օրինաչափությունը ժամանակի ընթացքում մնացել է անփոփոխ (Նկար 4a–f և լրացուցիչ նկար 8c–f, k): GA ազդանշանի աճով IPR-ում բջիջների տարածական կազմակերպումը վերլուծելու համար մենք Ler IPR բջիջները նշել ենք P4-ի վերևում և կողքերում՝ ըստ առաջին դիտարկումից 34 ժամ անց վերլուծված դրանց զարգացման ճակատագրի, այսինքն՝ երկուից ավելի պլաստիդային անգամ, ինչը թույլ է տալիս մեզ հետևել IPR բջիջներին պրիմորդիումի զարգացման ընթացքում P1/P2-ից մինչև P4: Մենք օգտագործել ենք երեք տարբեր գույներ՝ դեղին այն բջիջների համար, որոնք ինտեգրվել են պրիմորդիումին P4-ի մոտ, կանաչ՝ նրանց համար, որոնք գտնվում էին IPR-ում, և մանուշակագույն՝ նրանց համար, որոնք մասնակցել են երկու գործընթացներին (Նկար 7a–c): t0 (0 h)-ում P4-ի առջև տեսանելի էին IPR բջիջների 1-2 շերտեր (Նկար 7a): Ինչպես և սպասվում էր, երբ այս բջիջները բաժանվեցին, դրանք հիմնականում տեղի ունեցան լայնակի բաժանման հարթության միջոցով (Նկ. 7a–c): Նմանատիպ արդյունքներ ստացվեցին Col-0 SAM-ի միջոցով (կենտրոնանալով P3-ի վրա, որի սահմանը ծալվում է Ler-ում P4-ի նման), չնայած այս գենոտիպում ծաղկային սահմանում ձևավորված ծալքն ավելի արագ թաքցնում է IPR բջիջները (Նկ. 7g–i): Այսպիսով, IPR բջիջների բաժանման օրինաչափությունը նախապես կազմակերպում է բջիջները ճառագայթային շարքերի, ինչպես միջհանգույցներում: Ռադիալ շարքերի կազմակերպումը և IPR բջիջների տեղայնացումը հաջորդական օրգանների միջև ենթադրում են, որ այս բջիջները միջհանգույցային նախորդներ են:
Այստեղ մենք մշակել ենք ռատիոմետրիկ GA ազդանշանային կենսասենսոր՝ qmRGA, որը թույլ է տալիս քանակականորեն քարտեզագրել GA և GA ընկալիչների համակցված կոնցենտրացիաներից առաջացող GA ազդանշանային ակտիվությունը՝ միաժամանակ նվազագույնի հասցնելով էնդոգեն ազդանշանային ուղիների հետ միջամտությունը, այդպիսով տրամադրելով տեղեկատվություն GA ֆունկցիայի վերաբերյալ բջջային մակարդակում: Այս նպատակով մենք կառուցել ենք DELLA սպիտակուց՝ mRGA, որը կորցրել է DELLA փոխազդեցության գործընկերներին կապվելու ունակությունը, բայց մնում է զգայուն GA-ի կողմից առաջացած պրոտեոլիզի նկատմամբ: qmRGA-ն արձագանքում է GA մակարդակների ինչպես էկզոգեն, այնպես էլ էնդոգեն փոփոխություններին, և դրա դինամիկ զգայունության հատկությունները հնարավորություն են տալիս գնահատել GA ազդանշանային ակտիվության տարածաժամանակային փոփոխությունները զարգացման ընթացքում: qmRGA-ն նաև շատ ճկուն գործիք է, քանի որ այն կարող է հարմարվել տարբեր հյուսվածքների՝ փոխելով դրա արտահայտման համար օգտագործվող պրոմոտորը (անհրաժեշտության դեպքում), և հաշվի առնելով GA ազդանշանային ուղու և PFYRE մոտիվի պահպանված բնույթը անգիոսերմերի շրջանում, այն, հավանաբար, կարող է փոխանցվել այլ տեսակների22: Համապատասխանաբար, բրնձի SLR1 DELLA սպիտակուցի (HYY497AAA) համարժեք մուտացիան նույնպես ճնշում է SLR1-ի աճի ճնշող ակտիվությունը՝ միաժամանակ միայն աննշանորեն նվազեցնելով դրա GA-միջնորդավորված քայքայումը, նման mRGA23-ին: Նշենք, որ Arabidopsis-ի վերջին ուսումնասիրությունները ցույց են տվել, որ PFYRE տիրույթում մեկ ամինաթթվային մուտացիան (S474L) փոփոխել է RGA-ի տրանսկրիպցիոն ակտիվությունը՝ առանց ազդելու տրանսկրիպցիոն գործոնի գործընկերների հետ փոխազդելու դրա ունակության վրա50: Չնայած այս մուտացիան շատ մոտ է mRGA-ում առկա 3 ամինաթթվային փոխարինումներին, մեր ուսումնասիրությունները ցույց են տալիս, որ այս երկու մուտացիաները փոխում են DELLA-ի տարբեր բնութագրերը: Չնայած տրանսկրիպցիոն գործոնի գործընկերների մեծ մասը կապվում է DELLA26-ի LHR1 և SAW տիրույթներին,51 PFYRE տիրույթում որոշ պահպանված ամինաթթուներ կարող են օգնել կայունացնել այս փոխազդեցությունները:
Միջհանգույցների զարգացումը բույսերի ճարտարապետության և բերքատվության բարելավման հիմնական հատկանիշ է: qmRGA-ն բացահայտեց GA ազդանշանային ավելի բարձր ակտիվություն IPR միջհանգույցային նախորդ բջիջներում: Քանակական պատկերման և գենետիկայի համադրմամբ մենք ցույց տվեցինք, որ GA ազդանշանային օրինաչափությունները վերադրում են SAM էպիդերմիսում շրջանաձև/լայնակի բջջային բաժանման հարթությունները՝ ձևավորելով միջհանգույցների զարգացման համար անհրաժեշտ բջջային բաժանման կազմակերպումը: Զարգացման ընթացքում հայտնաբերվել են բջջային բաժանման հարթության կողմնորոշման մի քանի կարգավորիչներ52,53: Մեր աշխատանքը հստակ օրինակ է տալիս, թե ինչպես է GA ազդանշանային ակտիվությունը կարգավորում այս բջջային պարամետրը: DELLA-ն կարող է փոխազդել նախածալվող սպիտակուցային համալիրների հետ41, ուստի GA ազդանշանային ուղին կարող է կարգավորել բջջային բաժանման հարթության կողմնորոշումը՝ անմիջականորեն ազդելով կեղևային միկրոխողովակների կողմնորոշման վրա40,41,54,55: Մենք անսպասելիորեն ցույց տվեցինք, որ SAM-ում GA ազդանշանային ավելի բարձր ակտիվության համարժեքը ոչ թե բջիջների երկարացումը կամ բաժանումն էր, այլ միայն աճի անիզոտրոպիան, որը համապատասխանում է GA-ի անմիջական ազդեցությանը IPR-ում բջջային բաժանման ուղղության վրա: Այնուամենայնիվ, մենք չենք կարող բացառել, որ այս ազդեցությունը կարող է լինել նաև անուղղակի, օրինակ՝ միջնորդված GA-ի կողմից առաջացած բջջային պատի փափկեցմամբ56: Բջջային պատի հատկությունների փոփոխությունները առաջացնում են մեխանիկական լարվածություն57,58, որը կարող է նաև ազդել բջջային բաժանման հարթության կողմնորոշման վրա՝ ազդելով կեղևային միկրոխողովակների կողմնորոշման վրա39,46,59: GA-ի կողմից առաջացած մեխանիկական լարվածության և GA-ի կողմից միկրոխողովակների կողմնորոշման ուղղակի կարգավորման համակցված ազդեցությունները կարող են ներգրավված լինել IPR-ում բջջային բաժանման կողմնորոշման որոշակի օրինաչափության առաջացման մեջ՝ միջհանգույցները սահմանելու համար, և այս գաղափարը ստուգելու համար անհրաժեշտ են հետագա ուսումնասիրություններ: Նմանապես, նախորդ ուսումնասիրությունները ընդգծել են DELLA-փոխազդող TCP14 և 15 սպիտակուցների կարևորությունը միջհանգույցների ձևավորման վերահսկման գործում60,61, և այս գործոնները կարող են միջնորդել GA-ի ազդեցությունը BREVIPEDICELLUS (BP) և PENNYWISE (PNY) հետ միասին, որոնք կարգավորում են միջհանգույցների զարգացումը և, ինչպես ցույց է տրվել, ազդում են GA ազդանշանային ուղու վրա2,62: Հաշվի առնելով, որ DELLA-ները փոխազդում են բրազինոստերոիդի, էթիլենի, ջասմոնաթթվի և աբսցիսաթթվի (ABA) ազդանշանային ուղիների հետ63,64, և որ այս հորմոնները կարող են ազդել միկրոխողովակների կողմնորոշման վրա65, GA-ի ազդեցությունը բջջային բաժանման կողմնորոշման վրա կարող է միջնորդվել նաև այլ հորմոններով։
Վաղ ցիտոլոգիական ուսումնասիրությունները ցույց են տվել, որ Arabidopsis SAM-ի ներքին և արտաքին շրջանները անհրաժեշտ են միջհանգույցների զարգացման համար2,42: Այն փաստը, որ GA-ն ակտիվորեն կարգավորում է բջիջների բաժանումը ներքին հյուսվածքներում12, հաստատում է GA-ի կրկնակի գործառույթը՝ կարգավորելով մերիստեմը և միջհանգույցի չափը SAM-ում: Ուղղորդված բջջային բաժանման օրինաչափությունը նույնպես խստորեն կարգավորվում է ներքին SAM հյուսվածքում, և այս կարգավորումը կարևոր է ցողունի աճի համար52: Հետաքրքիր կլինի ուսումնասիրել, թե արդյոք GA-ն նույնպես դեր է խաղում բջջային բաժանման հարթության կողմնորոշման գործում ներքին SAM կազմակերպությունում, այդպիսով համաժամեցնելով միջհանգույցների սպեցիֆիկացիան և զարգացումը SAM-ի ներսում:
Բույսերը in vitro աճեցվել են հողում կամ 1x Murashige-Skoog (MS) միջավայրում (Duchefa), որը լրացված է 1% սախարոզով և 1% ագարով (Sigma) ստանդարտ պայմաններում (16 ժամ լույս, 22 °C), բացառությամբ հիպոկոտիլի և արմատների աճի փորձերի, որոնցում սածիլները աճեցվել են ուղղահայաց թիթեղների վրա՝ հաստատուն լույսի և 22 °C ջերմաստիճանի պայմաններում: Նիտրատի փորձերի համար բույսերը աճեցվել են մոդիֆիկացված MS միջավայրի վրա (bioWORLD բուսական միջավայր), որը լրացված է բավարար նիտրատով (0 կամ 10 մՄ KNO3), 0.5 մՄ NH4-սուկցինատով, 1% սախարոզով և 1% A-ագարով (Sigma)՝ երկար օրվա պայմաններում:
pDONR221-ի մեջ ներդրված GID1a կԴՆԹ-ն վերամիավորվեց pDONR P4-P1R-pUBQ10-ի և pDONR P2R-P3-mCherry-ի հետ՝ pB7m34GW-ի մեջ՝ pUBQ10::GID1a-mCherry առաջացնելու համար: pDONR221-ի մեջ ներդրված IDD2 ԴՆԹ-ն վերամիավորվեց pB7RWG266-ի մեջ՝ p35S:IDD2-RFP առաջացնելու համար: pGID1b::2xmTQ2-GID1b ստանալու համար, GID1b կոդավորող շրջանից վերև գտնվող 3.9 կբ բեկորը և GID1b կԴՆԹ-ն (1.3 կբ) և տերմինատորը (3.4 կբ) պարունակող 4.7 կբ բեկորը նախ ուժեղացվեցին՝ օգտագործելով լրացուցիչ աղյուսակ 3-ում ներկայացված պրայմերները, այնուհետև տեղադրվեցին համապատասխանաբար pDONR P4-P1R (Thermo Fisher Scientific) և pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific) մեջ, և վերջապես վերամիավորվեցին pDONR221 2xmTQ268-ի հետ pGreen 012567 թիրախային վեկտորի մեջ՝ օգտագործելով Gateway կլոնավորումը։ pCUC2::LSSmOrange-ը ստանալու համար, CUC2 պրոմոտորային հաջորդականությունը (ATG-ից 3229 զույգ հիմք վերև), որին հաջորդեց մեծ Սթոքսի տեղաշարժված mOrange (LSSmOrange)69 կոդավորող հաջորդականությունը՝ N7 միջուկային տեղայնացման ազդանշանով և NOS տրանսկրիպցիոն տերմինատորով, հավաքվեցին pGreen կանամիցինի թիրախային վեկտորի մեջ՝ օգտագործելով Gateway 3-fragment ռեկոմբինացիոն համակարգը (Invitrogen): Բույսի երկուական վեկտորը ներմուծվեց Agrobacterium tumefaciens GV3101 շտամի մեջ և ներմուծվեց Nicotiana benthamiana տերևների մեջ՝ Agrobacterium ինֆիլտրացիայի մեթոդով, և Arabidopsis thaliana Col-0-ի մեջ՝ ծաղկային թաթախման մեթոդով, համապատասխանաբար: pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry և pCLV3::mCherry-NLS qmRGA-ն անջատվեցին համապատասխանաբար խաչասերումների F3 և F1 սերունդներից:
ՌՆԹ-ի տեղում հիբրիդացումը կատարվել է մոտավորապես 1 սմ երկարությամբ ընձյուղների ծայրերի վրա72, որոնք հավաքվել և անմիջապես ֆիքսվել են FAA լուծույթում (3.7% ֆորմալդեհիդ, 5% քացախաթթու, 50% էթանոլ), որը նախապես սառեցվել է մինչև 4°C: 2 × 15 րոպե վակուումային մշակումից հետո ֆիքսատորը փոխվել է, և նմուշները ինկուբացվել են գիշերը: GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2 և RGL3 կԴՆԹ-ները և դրանց 3'-UTR-ների հակասենս զոնդերը սինթեզվել են լրացուցիչ աղյուսակ 3-ում ներկայացված պրայմերների միջոցով, ինչպես նկարագրվել է Ռոզիերի և այլոց կողմից73: Դիգօքսիգենինով նշագրված զոնդերը իմունոդետեկցվել են դիգօքսիգենինի հակամարմինների միջոցով (3000-ապատիկ նոսրացում; Roche, կատալոգի համար՝ 11 093 274 910), իսկ հատույթները ներկվել են 5-բրոմ-4-քլոր-3-ինդոլիլ ֆոսֆատի (BCIP, 250-ապատիկ նոսրացում)/նիտրոկապույտ տետրազոլիումի (NBT, 200-ապատիկ նոսրացում) լուծույթով։