Գիբերելինի քանակական բիոսենսորը բացահայտում է գիբերելինների դերը միջհանգույցների ճշգրտման մեջ կրակոցի գագաթային մերիստեմում

Ծիլերի գագաթային մերիստեմի (SAM) աճը չափազանց կարևոր է ցողունային ճարտարապետության համար: Բուսական հորմոններգիբերելիններ(GA-ները) առանցքային դեր են խաղում բույսերի աճի համակարգման գործում, սակայն նրանց դերը ՍԱՄ-ում դեռևս վատ է ճանաչված: Այստեղ մենք մշակեցինք GA ազդանշանի ռատիոմետրիկ կենսասենսոր՝ մշակելով DELLA սպիտակուցը՝ ճնշելու նրա հիմնական կարգավորիչ գործառույթը GA-ի տրանսկրիպցիոն արձագանքում՝ միաժամանակ պահպանելով դրա դեգրադացիան GA-ի ճանաչման ժամանակ: Մենք ցույց ենք տալիս, որ դեգրադացիայի վրա հիմնված այս բիոսենսորը ճշգրտորեն գրանցում է GA մակարդակների և բջջային զգայության փոփոխությունները զարգացման ընթացքում: Մենք օգտագործեցինք այս կենսատվիչը՝ SAM-ում GA ազդանշանային ակտիվությունը քարտեզագրելու համար: Մենք ցույց ենք տալիս, որ բարձր GA ազդանշանները հիմնականում առկա են օրգանների պրիմորդիայի միջև տեղակայված բջիջներում, որոնք միջհանգույց բջիջների պրեկուրսորներ են: Օգտագործելով շահույթի և ֆունկցիայի կորստի մոտեցումները, մենք հետագայում ցույց ենք տալիս, որ GA-ն կարգավորում է բջիջների բաժանման հարթության կողմնորոշումը, հաստատելով միջհանգույցների կանոնական բջջային կազմակերպությունը՝ դրանով իսկ խթանելով միջհանգույցների ճշգրտումը SAM-ում:
Ծիլերի գագաթային մերիստեմը (SAM), որը գտնվում է ցողունի գագաթին, պարունակում է ցողունային բջիջների խորշ, որոնց ակտիվությունը մոդուլային և կրկնվող ձևով առաջացնում է կողային օրգաններ և ցողունային հանգույցներ բույսի ողջ կյանքի ընթացքում: Այս կրկնվող միավորներից յուրաքանչյուրը կամ բույսերի հանգույցները ներառում են միջհանգույցներ և կողային օրգաններ հանգույցներում, և առանցքային մերիստեմներ՝ տերևի առանցքներում1: Զարգացման ընթացքում փոխվում է բույսերի հանգույցների աճն ու կազմակերպումը։ Արաբիդոպսիսում միջգնդային աճը ճնշվում է վեգետատիվ փուլում, իսկ առանցքային մերիստեմները մնում են քնած վարդերի տերևների առանցքներում։ Ծաղկային փուլին անցնելիս ՍԱՄ-ը դառնում է ծաղկաբուծության մերիստեմ՝ առաջացնելով երկարավուն միջհանգույցներ և առանցքային բողբոջներ, տերևների առանցքներում ճյուղավորներ, իսկ ավելի ուշ՝ անտերև ծաղիկներ2: Թեև մենք զգալի առաջընթաց ենք գրանցել տերևների, ծաղիկների և ճյուղերի սկիզբը վերահսկող մեխանիզմների ըմբռնման հարցում, համեմատաբար քիչ բան է հայտնի այն մասին, թե ինչպես են առաջանում միջհանգույցները:
ԳԱ-ների տարածական ժամանակային բաշխումը հասկանալը կօգնի ավելի լավ հասկանալ այս հորմոնների գործառույթները տարբեր հյուսվածքներում և զարգացման տարբեր փուլերում: RGA-GFP միաձուլման դեգրադացիայի պատկերացումը, որն արտահայտված է իր իսկ պրոմոութորի գործողությամբ, կարևոր տեղեկատվություն է տալիս արմատներում GA-ի ընդհանուր մակարդակների կարգավորման վերաբերյալ15,16: Այնուամենայնիվ, RGA արտահայտությունը տարբերվում է հյուսվածքներում17 և կարգավորվում է GA18-ով: Այսպիսով, RGA խթանողի դիֆերենցիալ արտահայտությունը կարող է հանգեցնել RGA-GFP-ով նկատվող ֆլյուորեսցենտային օրինաչափության, և, հետևաբար, այս մեթոդը քանակական չէ: Վերջերս, կենսաակտիվ ֆլուորեսցեին (Fl) պիտակավորված GA19,20-ը բացահայտեց GA-ի կուտակումը արմատային էնդոկորտեքսում և նրա բջջային մակարդակների կարգավորումը GA տրանսպորտի միջոցով: Վերջերս GA FRET սենսորը nlsGPS1 ցույց տվեց, որ GA մակարդակները փոխկապակցված են արմատների, թելերի և մուգ հասուն հիպոկոտիլների բջիջների երկարացման հետ21: Այնուամենայնիվ, ինչպես տեսանք, GA-ի կոնցենտրացիան միակ պարամետրը չէ, որը վերահսկում է GA ազդանշանային ակտիվությունը, քանի որ այն կախված է զգայական բարդ գործընթացներից: Այստեղ, հիմնվելով DELLA-ի և GA-ի ազդանշանային ուղիների մասին մեր պատկերացումների վրա, մենք զեկուցում ենք GA ազդանշանի դեգրադացիայի վրա հիմնված հարաբերակցական կենսասենսորի մշակման և բնութագրման մասին: Այս քանակական կենսասենսորը մշակելու համար մենք օգտագործեցինք մուտանտ GA-զգայուն RGA, որը միաձուլված էր լյումինեսցենտ սպիտակուցի հետ և ամենուր արտահայտվում էր հյուսվածքներում, ինչպես նաև GA-ին անզգայուն լյումինեսցենտ սպիտակուց: Մենք ցույց ենք տալիս, որ մուտանտ RGA սպիտակուցի միաձուլումները չեն խանգարում էնդոգեն GA ազդանշանին, երբ ամենուրեք արտահայտվում է, և որ այս կենսացուցիչը կարող է քանակականացնել ազդանշանային ակտիվությունը, որն առաջանում է ինչպես GA մուտքագրման, այնպես էլ GA ազդանշանի մշակման արդյունքում՝ զգայական սարքի կողմից բարձր տարածական ժամանակային լուծաչափով: Մենք օգտագործեցինք այս բիոսենսորը՝ քարտեզագրելու GA ազդանշանային ակտիվության տարածական ժամանակային բաշխումը և քանակականացնելու, թե ինչպես է GA-ն կարգավորում բջջային վարքը SAM էպիդերմիսում: Մենք ցույց ենք տալիս, որ GA-ն կարգավորում է SAM բջիջների բաժանման հարթության կողմնորոշումը, որը գտնվում է օրգան պրիմորդիայի միջև՝ դրանով իսկ սահմանելով միջհանգույցի կանոնական բջջային կազմակերպումը:
Ի վերջո, մենք հարցրինք, թե արդյոք qmRGA-ն կարող է հաղորդել էնդոգեն GA մակարդակների փոփոխություններ՝ օգտագործելով աճող հիպոկոտիլներ: Մենք նախկինում ցույց տվեցինք, որ նիտրատը խթանում է աճը՝ մեծացնելով GA սինթեզը և, իր հերթին, DELLA34-ի քայքայումը: Համապատասխանաբար, մենք նկատեցինք, որ pUBQ10::qmRGA սածիլներում աճեցված նիտրատների առատ մատակարարման պայմաններում (10 մՄ NO3−) ավելի երկար էր, քան նիտրատների անբավարարության պայմաններում աճեցված սածիլների երկարությունը (Լրացուցիչ նկար 6ա): Աճի պատասխանին համապատասխան՝ GA ազդանշաններն ավելի բարձր են եղել 10 մՄ NO3- պայմաններում աճեցված սածիլների հիպոկոտիլներում, քան նիտրատի բացակայության պայմաններում աճեցված սածիլներում (Լրացուցիչ նկար 6b, c): Այսպիսով, qmRGA-ն նաև հնարավորություն է տալիս մոնիտորինգի ենթարկել GA ազդանշանային փոփոխությունները, որոնք առաջացել են GA կոնցենտրացիայի էնդոգեն փոփոխություններով:
Հասկանալու համար, թե qmRGA-ի կողմից հայտնաբերված GA ազդանշանային ակտիվությունը կախված է GA կոնցենտրացիայից և GA ընկալումից, ինչպես և սպասվում էր սենսորային դիզայնի հիման վրա, մենք վերլուծեցինք երեք GID1 ընկալիչների արտահայտությունը վեգետատիվ և վերարտադրողական հյուսվածքներում: Սածիլների մեջ GID1-GUS ռեպորտաժային գիծը ցույց տվեց, որ GID1a-ն և c-ն բարձր արտահայտված են կոթիլեդոններում (նկ. 3a–c): Բացի այդ, բոլոր երեք ընկալիչները արտահայտված էին տերևներում, կողային արմատային պրիմորդիայում, արմատների ծայրերում (բացառությամբ GID1b-ի արմատային գլխարկի) և անոթային համակարգում (նկ. 3a–c): Ծաղկաբույլում SAM-ում մենք հայտնաբերեցինք GUS ազդանշաններ միայն GID1b-ի և 1c-ի համար (Լրացուցիչ նկ. 7a–c): In situ հիբրիդացումը հաստատեց արտահայտման այս օրինաչափությունները և հետագայում ցույց տվեց, որ GID1c-ը միատեսակ արտահայտված էր ցածր մակարդակներում SAM-ում, մինչդեռ GID1b-ը ցույց տվեց ավելի բարձր արտահայտություն SAM-ի ծայրամասում (Լրացուցիչ նկար 7d–l): pGID1b::2xmTQ2-GID1b թարգմանական միաձուլումը բացահայտեց նաև GID1b արտահայտության աստիճանավորված տիրույթ՝ ցածր կամ առանց արտահայտման SAM-ի կենտրոնում մինչև օրգանների սահմանների բարձր արտահայտումը (Լրացուցիչ նկար 7 մ): Այսպիսով, GID1 ընկալիչները միատեսակ չեն բաշխված հյուսվածքների միջով և ներսում: Հետագա փորձերում մենք նաև նկատեցինք, որ GID1-ի գերարտահայտումը (pUBQ10::GID1a-mCherry) բարձրացրեց qmRGA-ի զգայունությունը հիպոկոտիլներում արտաքին GA կիրառման նկատմամբ (նկ. 3d, e): Ի հակադրություն, հիպոկոտիլում qd17mRGA-ով չափված ֆլուորեսցենցիան անզգայուն էր GA3 բուժման նկատմամբ (նկ. 3f, g): Երկու փորձարկումների համար էլ սածիլները մշակվել են GA-ի բարձր կոնցենտրացիաներով (100 μM GA3)՝ գնահատելու սենսորի արագ վարքը, որտեղ ուժեղացել կամ կորել է GID1 ընկալիչին միանալու ունակությունը: Այս արդյունքները միասին հաստատում են, որ qmRGA բիոսենսորը կատարում է համակցված գործառույթ՝ որպես GA և GA սենսոր, և ենթադրում է, որ GID1 ընկալիչի դիֆերենցիալ արտահայտությունը կարող է զգալիորեն փոփոխել սենսորի արտանետումը:
Մինչ օրս GA ազդանշանների բաշխումը SAM-ում մնում է անհասկանալի: Հետևաբար, մենք օգտագործեցինք qmRGA-արտահայտող բույսեր և pCLV3::mCherry-NLS ցողունային բջիջների թղթակից35՝ GA ազդանշանային գործունեության բարձր լուծաչափով քանակական քարտեզները հաշվարկելու համար՝ կենտրոնանալով L1 շերտի վրա (էպիդերմիս; նկ. 4a, b, տես Մեթոդներ և լրացուցիչ մեթոդներ SAM-ի աճի վերահսկման հիմնական դերը a31-ում): Այստեղ pCLV3::mCherry-NLS արտահայտությունը տրամադրեց ֆիքսված երկրաչափական հղման կետ GA ազդանշանային գործունեության տարածական ժամանակային բաշխումը վերլուծելու համար37: Չնայած GA-ն կարևոր է համարվում կողային օրգանների զարգացման համար4, մենք նկատեցինք, որ GA ազդանշանները ցածր էին ծաղկային պրիմորդիումում (P)՝ սկսած P3 փուլից (նկ. 4a, b), մինչդեռ երիտասարդ P1 և P2 պրիմորդիումներն ունեին չափավոր ակտիվություն, որը նման էր կենտրոնական շրջանում (նկ. 4a, b): Ավելի բարձր GA ազդանշանային ակտիվություն է հայտնաբերվել օրգանների պրիմորդիումի սահմաններում՝ սկսած P1/P2-ից (սահմանի կողքերից) և գագաթնակետին հասնելով P4-ում, ինչպես նաև ծայրամասային շրջանի բոլոր բջիջներում, որոնք գտնվում են պրիմորդիայի միջև (նկ. 4a, b և լրացուցիչ նկ. 8a, b): Այս ավելի բարձր GA ազդանշանային ակտիվությունը նկատվել է ոչ միայն էպիդերմիսում, այլ նաև L2 և L3 վերին շերտերում (Լրացուցիչ նկար 8b): QmRGA-ի օգտագործմամբ SAM-ում հայտնաբերված GA ազդանշանների օրինաչափությունը նույնպես ժամանակի ընթացքում մնաց անփոփոխ (Լրացուցիչ Նկ. 8c–f, k): Չնայած qd17mRGA կոնստրուկցիան համակարգված կերպով կարգավորվել է T3 բույսերի SAM-ում հինգ անկախ գծերից, որոնք մենք մանրամասնորեն բնութագրել ենք, մենք կարողացանք վերլուծել ֆլյուորեսցենտային օրինաչափությունները, որոնք ստացվել են pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP կառուցվածքով (Լրացուցիչ նկար 8g–j, l): Այս հսկողության գծում միայն ֆլյուորեսցենտային հարաբերակցության աննշան փոփոխություններ են հայտնաբերվել SAM-ում, սակայն SAM կենտրոնում մենք նկատեցինք VENUS-ի հստակ և անսպասելի նվազում՝ կապված TagBFP-ի հետ: Սա հաստատում է, որ qmRGA-ի կողմից դիտված ազդանշանային օրինաչափությունը արտացոլում է mRGA-VENUS-ի GA-ից կախված դեգրադացիան, բայց նաև ցույց է տալիս, որ qmRGA-ն կարող է գերագնահատել GA ազդանշանային ակտիվությունը մերիստեմի կենտրոնում: Ամփոփելով, մեր արդյունքները բացահայտում են GA ազդանշանային օրինաչափություն, որը հիմնականում արտացոլում է պրիմորդիայի բաշխումը: Միջնախնական շրջանի (IPR) այս բաշխումը պայմանավորված է զարգացող պրիմորդիումի և կենտրոնական շրջանի միջև GA ազդանշանային բարձր ակտիվության աստիճանական հաստատմամբ, մինչդեռ միևնույն ժամանակ GA ազդանշանային ակտիվությունը պրիմորդիումում նվազում է (նկ. 4c, d):
GID1b և GID1c ընկալիչների բաշխումը (տես վերևում) ենթադրում է, որ GA ընկալիչների դիֆերենցիալ արտահայտությունը օգնում է ձևավորել GA ազդանշանային գործունեության օրինակը SAM-ում: Մենք հետաքրքրվեցինք, թե արդյոք հնարավոր է GA-ի դիֆերենցիալ կուտակում: Այս հնարավորությունը ուսումնասիրելու համար մենք օգտագործեցինք nlsGPS1 GA FRET սենսոր21: Ակտիվացման հաճախականության բարձրացում է հայտնաբերվել nlsGPS1-ի SAM-ում, որը մշակվել է 10 մկՄ GA4+7-ով 100 րոպեի ընթացքում (Լրացուցիչ Նկ. 9a–e), ինչը ցույց է տալիս, որ nlsGPS1-ն արձագանքում է SAM-ում GA կոնցենտրացիայի փոփոխություններին, ինչպես դա անում է արմատներում21: nlsGPS1 ակտիվացման հաճախականության տարածական բաշխումը բացահայտեց համեմատաբար ցածր GA մակարդակներ SAM-ի արտաքին շերտերում, բայց ցույց տվեց, որ դրանք բարձրացված են SAM-ի կենտրոնում և սահմաններում (նկ. 4e և լրացուցիչ նկ. 9a,c): Սա ենթադրում է, որ GA-ն նաև բաշխված է SAM-ում տարածական օրինաչափությամբ, որը համեմատելի է qmRGA-ի կողմից բացահայտվածի հետ: Որպես լրացուցիչ մոտեցում, մենք նաև SAM-ին վերաբերվել ենք լյումինեսցենտ GA-ով (GA3-, GA4-, GA7-Fl) կամ միայնակ Fl-ով որպես բացասական հսկողություն: Fl ազդանշանը բաշխվել է ամբողջ SAM-ով, ներառյալ կենտրոնական շրջանը և պրիմորդիան, թեև ավելի ցածր ինտենսիվությամբ (նկ. 4j և լրացուցիչ նկ. 10d): Ի հակադրություն, բոլոր երեք GA-Fl-ն կուտակվել են հատուկ պրիմորդիումի սահմաններում և տարբեր աստիճաններով ՄՍՀ-ի մնացած մասում, ընդ որում GA7-Fl-ը կուտակվել է IPR-ի ամենամեծ տիրույթում (նկ. 4k և լրացուցիչ նկ. 10a,b): Ֆլուորեսցենցիայի ինտենսիվության քանակական հաշվարկը ցույց տվեց, որ IPR-ի նկատմամբ ոչ IPR ինտենսիվության հարաբերակցությունը ավելի բարձր է եղել GA-Fl-ով մշակված SAM-ում, համեմատած Fl-ով մշակված SAM-ի հետ (նկ. 4l և լրացուցիչ նկ. 10c): Այս արդյունքները միասին ցույց են տալիս, որ GA-ն առկա է ավելի բարձր կոնցենտրացիաներում IPR բջիջներում, որոնք գտնվում են օրգանի սահմանին ամենամոտ: Սա ենթադրում է, որ SAM GA ազդանշանային գործունեության օրինաչափությունը առաջանում է ինչպես GA ընկալիչների դիֆերենցիալ արտահայտումից, այնպես էլ GA-ի դիֆերենցիալ կուտակումից IPR բջիջներում օրգանների սահմանների մոտ: Այսպիսով, մեր վերլուծությունը բացահայտեց GA ազդանշանի անսպասելի տարածական ժամանակային օրինաչափություն՝ ավելի ցածր ակտիվությամբ SAM-ի կենտրոնում և պրիմորդումում և ավելի բարձր ակտիվությամբ IPR-ում՝ ծայրամասային շրջանում:
SAM-ում դիֆերենցիալ GA ազդանշանային գործունեության դերը հասկանալու համար մենք վերլուծել ենք GA ազդանշանային ակտիվության, բջիջների ընդլայնման և բջիջների բաժանման հարաբերակցությունը՝ օգտագործելով SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS-ի իրական ժամանակի ժամանակային պատկերը: Հաշվի առնելով GA-ի դերը աճի կարգավորման գործում, ակնկալվում էր դրական հարաբերակցություն բջիջների ընդլայնման պարամետրերի հետ: Հետևաբար, մենք նախ համեմատեցինք GA ազդանշանային գործունեության քարտեզները բջջի մակերևույթի աճի արագության քարտեզների հետ (որպես տվյալ բջջի և դուստր բջիջների բաժանման ժամանակ բջիջների ընդարձակման ուժի վստահելի) և աճի անիզոտրոպիայի քարտեզների հետ, որը չափում է բջիջների ընդլայնման ուղղորդվածությունը (այստեղ օգտագործվում է նաև տվյալ բջջի և դուստր բջիջների համար՝ բաժանման ժամանակ, նկ. 5): SAM բջիջների մակերևույթի աճի տեմպի մեր քարտեզները համահունչ են նախորդ դիտարկումներին38,39, եզրագծում աճի նվազագույն տեմպերով և զարգացող ծաղիկների աճի առավելագույն տեմպերով (նկ. 5ա): Հիմնական բաղադրիչի վերլուծությունը (PCA) ցույց է տվել, որ GA ազդանշանային ակտիվությունը բացասաբար փոխկապակցված է բջջային մակերեսի աճի ինտենսիվության հետ (Նկար 5c): Մենք նաև ցույց տվեցինք, որ փոփոխության հիմնական առանցքները, ներառյալ GA ազդանշանային մուտքը և աճի ինտենսիվությունը, ուղղանկյուն էին դեպի այն ուղղությունը, որը որոշվում էր բարձր CLV3 արտահայտությամբ՝ հաստատելով բջիջների բացառումը SAM կենտրոնից մնացած վերլուծություններում: Սփիրմանի հարաբերակցության վերլուծությունը հաստատեց PCA-ի արդյունքները (Նկար 5դ), ցույց տալով, որ IPR-ում ավելի բարձր GA ազդանշանները չեն հանգեցրել բջիջների ավելի մեծ ընդլայնման: Այնուամենայնիվ, հարաբերակցության վերլուծությունը բացահայտեց մի փոքր դրական հարաբերակցություն GA ազդանշանային գործունեության և աճի անիզոտրոպիայի միջև (Նկար 5c, d), ինչը ենթադրում է, որ IPR-ում ավելի բարձր GA ազդանշանն ազդում է բջիջների աճի ուղղության վրա և, հնարավոր է, բջիջների բաժանման հարթության դիրքի վրա:
a, b Մակերեւույթի միջին աճի (ա) և աճի անիզոտրոպիայի (բ) ջերմային քարտեզները SAM-ում միջինացված են յոթ անկախ բույսերի վրա (համապատասխանաբար օգտագործվում են որպես բջջի ընդարձակման ուժի և ուղղության վստահված անձինք): c PCA վերլուծությունը ներառում էր հետևյալ փոփոխականները՝ GA ազդանշան, մակերեսի աճի ինտենսիվություն, մակերեսի աճի անիզոտրոպիա և CLV3 արտահայտություն: PCA բաղադրիչ 1-ը հիմնականում բացասաբար էր փոխկապակցված մակերեսային աճի ինտենսիվության հետ և դրականորեն փոխկապակցված GA ազդանշանի հետ: PCA բաղադրիչ 2-ը հիմնականում դրականորեն փոխկապակցված էր մակերեսի աճի անիզոտրոպիայի հետ և բացասաբար փոխկապակցված CLV3 արտահայտության հետ: Տոկոսները ներկայացնում են յուրաքանչյուր բաղադրիչի կողմից բացատրված տատանումները: դ Spearman հարաբերակցության վերլուծություն GA ազդանշանի, մակերևույթի աճի ինտենսիվության և մակերևույթի աճի անիզոտրոպիայի միջև հյուսվածքների մասշտաբով, բացառությամբ CZ-ի: Աջ համարը Spearman rho արժեքն է երկու փոփոխականների միջև: Աստղանիշները ցույց են տալիս դեպքեր, երբ հարաբերակցությունը/բացասական հարաբերակցությունը խիստ նշանակալի է: e Col-0 SAM L1 բջիջների 3D վիզուալիզացիա կոնֆոկալ մանրադիտակով: 10 ժամում SAM-ում (բայց ոչ պրիմորդիումում) ձևավորված նոր բջջային պատերը գունավորվում են ըստ իրենց անկյան արժեքների: Ներքևի աջ անկյունում ցուցադրված է գույնի սանդղակը: Ներդիրը ցույց է տալիս համապատասխան 3D պատկերը 0 ժամում: Փորձը կրկնվել է երկու անգամ՝ նմանատիպ արդյունքներով։ f Box գծապատկերները ցույց են տալիս բջիջների բաժանման արագությունները IPR-ում և ոչ IPR Col-0 SAM-ում (n = 10 անկախ բույսեր): Կենտրոնական գիծը ցույց է տալիս միջինը, իսկ վանդակի սահմանները ցույց են տալիս 25-րդ և 75-րդ տոկոսները: Բեղերը ցույց են տալիս R ծրագրաշարով որոշված ​​նվազագույն և առավելագույն արժեքները: P արժեքները ստացվել են Welch-ի երկու պոչ T-թեստով: g, h Սխեմատիկ դիագրամ, որը ցույց է տալիս (g) ինչպես չափել նոր բջջային պատի (magenta) անկյունը SAM-ի կենտրոնից (սպիտակ կետավոր գիծ) շառավղային ուղղության նկատմամբ (հաշվի են առնվում միայն սուր անկյան արժեքները, այսինքն՝ 0–90°), և (ը) շրջագծային/կողային և շառավղային ուղղությունները միջնամասում: i Բջիջների բաժանման հարթության կողմնորոշման հաճախականության հիստոգրամներ SAM-ով (մուգ կապույտ), IPR (միջին կապույտ) և ոչ IPR (բաց կապույտ), համապատասխանաբար: P արժեքները ստացվել են երկու պոչ Կոլմոգորով-Սմիրնով թեստի միջոցով: Փորձը կրկնվել է երկու անգամ՝ նմանատիպ արդյունքներով։ j IPR-ի բջիջների բաժանման հարթության կողմնորոշման հաճախականության հիստոգրամները համապատասխանաբար P3 (բաց կանաչ), P4 (միջին կանաչ) և P5 (մուգ կանաչ) շուրջ: P արժեքները ստացվել են երկու պոչ Կոլմոգորով-Սմիրնով թեստի միջոցով: Փորձը կրկնվել է երկու անգամ՝ նմանատիպ արդյունքներով։
Հետևաբար, մենք հաջորդաբար ուսումնասիրեցինք GA ազդանշանի և բջիջների բաժանման ակտիվության միջև կապը՝ հետազոտության ընթացքում հայտնաբերելով նոր ձևավորված բջջային պատերը (նկ. 5e): Այս մոտեցումը թույլ տվեց մեզ չափել բջիջների բաժանման հաճախականությունը և ուղղությունը: Զարմանալիորեն մենք պարզեցինք, որ IPR-ում և մնացած SAM-ում բջիջների բաժանման հաճախականությունը (ոչ IPR, Նկար 5f) նման էր, ինչը ցույց է տալիս, որ IPR և ոչ IPR բջիջների միջև GA ազդանշանային տարբերությունները էապես չեն ազդում բջիջների բաժանման վրա: Սա և GA ազդանշանների և աճի անիզոտրոպիայի միջև դրական հարաբերակցությունը մեզ դրդեցին մտածել, թե արդյոք GA ազդանշանային ակտիվությունը կարող է ազդել բջիջների բաժանման հարթության կողմնորոշման վրա: Մենք չափեցինք նոր բջջային պատի կողմնորոշումը որպես սուր անկյուն՝ մերիստեմի կենտրոնը և նոր բջջային պատի կենտրոնը միացնող շառավղային առանցքի նկատմամբ (նկ. 5e-i) և նկատեցինք, որ բջիջները բաժանվում են ճառագայթային առանցքի նկատմամբ 90°-ին մոտ անկյուններով, իսկ ամենաբարձր հաճախականությունները դիտվում են 80° (90° և 70-8%)-ում: (22.62%) (նկ. 5e,i), որը համապատասխանում է շրջագծային/լայնակի ուղղությամբ բջիջների բաժանմանը (նկ. 5h): Բջիջների բաժանման այս վարքագծի մեջ GA ազդանշանի ներդրումն ուսումնասիրելու համար մենք վերլուծեցինք բջիջների բաժանման պարամետրերը IPR-ում և ոչ IPR-ում առանձին (նկ. 5i): Մենք նկատեցինք, որ IPR բջիջներում բաժանման անկյան բաշխումը տարբերվում էր ոչ IPR բջիջներում կամ ամբողջ SAM-ի բջիջներում, ընդ որում IPR բջիջները ցուցադրում էին կողային/շրջանաձև բջիջների ավելի մեծ մասնաբաժին, այսինքն՝ 70–80° և 80–90° (համապատասխանաբար 33,86% և 30,71%, համապատասխան համամասնություններով): Այսպիսով, մեր դիտարկումները բացահայտեցին կապ GA բարձր ազդանշանների և բջիջների բաժանման հարթության կողմնորոշման միջև, որը մոտ է շրջագծային ուղղությանը, որը նման է GA ազդանշանային ակտիվության և աճի անիզոտրոպիայի հարաբերակցությանը (նկ. 5c, d): Այս ասոցիացիայի տարածական պահպանությունը հետագայում հաստատելու համար մենք չափեցինք բաժանման հարթության կողմնորոշումը IPR բջիջներում, որոնք շրջապատում են պրիմորդիումը` սկսած P3-ից, քանի որ ամենաբարձր GA ազդանշանային ակտիվությունը հայտնաբերվել է այս տարածաշրջանում` սկսած P4-ից (նկ. 4): P3-ի և P4-ի շուրջ IPR-ի բաժանման անկյունները վիճակագրորեն նշանակալի տարբերություններ չեն ցույց տվել, չնայած P4-ի շուրջ IPR-ում նկատվել է կողային բջիջների բաժանումների հաճախականության աճ (նկ. 5j): Այնուամենայնիվ, P5-ի շուրջ գտնվող IPR բջիջներում բջիջների բաժանման հարթության կողմնորոշման տարբերությունը դարձավ վիճակագրորեն նշանակալի՝ լայնակի բջիջների բաժանումների հաճախականության կտրուկ աճով (նկ. 5j): Այս արդյունքները միասին ցույց են տալիս, որ GA ազդանշանը կարող է վերահսկել SAM-ում բջիջների բաժանումների կողմնորոշումը, ինչը համահունչ է նախորդ զեկույցներին40,41 այն մասին, որ բարձր GA ազդանշանը կարող է առաջացնել IPR-ում բջջային բաժանումների կողային կողմնորոշում:
Կանխատեսվում է, որ IPR-ի բջիջները կներառվեն ոչ թե պրիմորդիայի, այլ միջհանգույցների մեջ2,42,43: IPR-ում բջիջների բաժանումների լայնակի կողմնորոշումը կարող է հանգեցնել միջհանգույցներում էպիդերմիսի բջիջների զուգահեռ երկայնական շարքերի բնորոշ կազմակերպմանը: Վերևում նկարագրված մեր դիտարկումները ցույց են տալիս, որ GA ազդանշանը, հավանաբար, դեր է խաղում այս գործընթացում՝ կարգավորելով բջիջների բաժանման ուղղությունը:
DELLA-ի մի քանի գեների ֆունկցիայի կորուստը հանգեցնում է GA-ի կառուցողական պատասխանի, և դելլա մուտանտները կարող են օգտագործվել այս վարկածը ստուգելու համար44: Մենք նախ վերլուծեցինք SAM-ում հինգ DELLA գեների արտահայտման ձևերը: GUS գծի տրանսկրիպցիոն միաձուլումը45 ցույց տվեց, որ GAI, RGA, RGL1 և RGL2 (շատ ավելի փոքր չափով) արտահայտված են SAM-ում (Լրացուցիչ նկար 11ա–դ): In situ հիբրիդացումը հետագայում ցույց տվեց, որ GAI mRNA-ն կուտակվում է հատուկ պրիմորդիայում և զարգացող ծաղիկներում (Լրացուցիչ նկար 11e): RGL1 և RGL3 mRNA-ն հայտնաբերվել է SAM-ի ողջ տարածքում և ավելի հին ծաղիկների մեջ, մինչդեռ RGL2 mRNA-ն ավելի առատ էր սահմանամերձ շրջանում (Լրացուցիչ նկար 11f–h): pRGL3::RGL3-GFP SAM-ի կոնֆոկալ պատկերումը հաստատեց in situ հիբրիդացման միջոցով դիտված արտահայտությունը և ցույց տվեց, որ RGL3 սպիտակուցը կուտակվում է SAM-ի կենտրոնական մասում (Լրացուցիչ նկար 11i): Օգտագործելով pRGA::GFP-RGA գիծը, մենք նաև պարզեցինք, որ RGA սպիտակուցը կուտակվում է SAM-ում, բայց դրա առատությունը նվազում է P4-ից սկսած սահմանին (Լրացուցիչ նկար 11j): Հատկանշական է, որ RGL3-ի և RGA-ի արտահայտման ձևերը համահունչ են IPR-ում GA ազդանշանային ավելի բարձր ակտիվությանը, ինչպես հայտնաբերվում է qmRGA-ի կողմից (նկ. 4): Ավելին, այս տվյալները ցույց են տալիս, որ բոլոր DELLA-ներն արտահայտված են SAM-ում և որ դրանց արտահայտությունը միասին ընդգրկում է ամբողջ SAM-ը:
Մենք հաջորդիվ վերլուծեցինք բջիջների բաժանման պարամետրերը վայրի տիպի SAM-ում (Ler, control) և gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della հնգապատիկ (գլոբալ) մուտանտներում (նկ. 6a, b): Հետաքրքիր է, որ մենք նկատեցինք վիճակագրորեն զգալի տեղաշարժ բջիջների բաժանման անկյունային հաճախականությունների բաշխման մեջ della գլոբալ մուտանտի SAM-ում՝ համեմատած վայրի տեսակի (նկ. 6c): Դելլա գլոբալ մուտանտի այս փոփոխությունը պայմանավորված էր 80–90° անկյունների հաճախականության ավելացմամբ (34,71% ընդդեմ 24,55%) և ավելի փոքր չափով 70–80° անկյունների (23,78% ընդդեմ 20,18%), այսինքն՝ համապատասխան բջիջների լայնակի բաժանումների (նկ.6c): Ոչ լայնակի բաժանումների հաճախականությունը (0–60°) նույնպես ավելի ցածր է եղել դելլա գլոբալ մուտանտում (նկ. 6c): Բջիջների լայնակի բաժանումների հաճախականությունը զգալիորեն ավելացել է della գլոբալ մուտանտի SAM-ում (նկ. 6b): IPR-ում բջիջների լայնակի բաժանումների հաճախականությունը նույնպես ավելի բարձր էր della գլոբալ մուտանտում, համեմատած վայրի տեսակի (նկ. 6d): IPR շրջանից դուրս վայրի տեսակն ուներ բջիջների բաժանման անկյունների ավելի միատեսակ բաշխում, մինչդեռ դելլա գլոբալ մուտանտը նախընտրում էր IPR-ի նման շոշափող բաժանումները (նկ. 6e): Մենք նաև քանակականացրել ենք ga2 օքսիդազի (ga2ox) հնգապատիկ մուտանտների (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1 և ga2ox6-2) բջիջների բաժանումների կողմնորոշումը, որը GA-անգործուն մուտանտի ֆոն է, որտեղ GA կուտակվում է: Համապատասխան GA մակարդակների աճին, հնգապատիկ ga2ox մուտանտի ծաղկաբույլի SAM-ն ավելի մեծ էր, քան Col-0-ը (Լրացուցիչ նկար 12a, բ), և Col-0-ի համեմատ, հնգապատիկ ga2ox SAM-ը ցույց տվեց բջջի բաժանման անկյունների հստակորեն տարբեր բաշխում, 50°-ի հաճախականության անկյունները կրկին մեծանալով 50°-ից մինչև i: բաժանումներ (Լրացուցիչ նկ. 12ա–գ): Այսպիսով, մենք ցույց ենք տալիս, որ GA ազդանշանային ակտիվացումը և GA կուտակումը առաջացնում են կողային բջիջների բաժանումներ IPR-ում և մնացած SAM-ում:
a, b PI-ով ներկված Ler (a) և գլոբալ della մուտանտի (b) SAM-ի L1 շերտի 3D պատկերացում՝ օգտագործելով համաֆոկալ մանրադիտակ: Նոր բջջային պատերը, որոնք ձևավորվել են SAM-ում (բայց ոչ պրիմորդիումում) 10 ժամվա ընթացքում, ցուցադրվում և գունավորվում են ըստ իրենց անկյան արժեքների: Ներդիրը ցույց է տալիս SAM-ը 0 ժ. Գույնի սանդղակը ցուցադրվում է ստորին աջ անկյունում: (b)-ի սլաքը ցույց է տալիս գլոբալ della mutant-ում հավասարեցված բջջային ֆայլերի օրինակ: Փորձը կրկնվել է երկու անգամ՝ նմանատիպ արդյունքներով։ Բջիջների բաժանման հարթության կողմնորոշումների հաճախականության բաշխման համեմատություն ամբողջ SAM (d), IPR (e) և ոչ IPR (f) Ler-ի և գլոբալ դելլայի միջև: P արժեքները ստացվել են երկու պոչ Կոլմոգորով-Սմիրնով թեստի միջոցով: f, g Col-0 (i) և pCUC2::gai-1-VENUS (j) տրանսգենային բույսերի PI- ներկված SAM-ի համաֆոկալ պատկերների 3D վիզուալիզացիա: Վահանակներ (a, b) ցույց են տալիս նոր բջջային պատերը (բայց ոչ պրիմորդիաները), որոնք ձևավորվել են SAM-ում 10 ժամվա ընթացքում: Փորձը կրկնվել է երկու անգամ՝ նմանատիպ արդյունքներով։ h–j Բջիջների բաժանման հարթության կողմնորոշումների հաճախականության բաշխման համեմատություն, որոնք տեղակայված են ամբողջ SAM (h), IPR (i) և ոչ IPR (j) Col-0 և pCUC2::gai-1-VENUS բույսերի միջև: P արժեքները ստացվել են Կոլմոգորով-Սմիրնով երկու պոչով թեստի միջոցով:
Մենք հաջորդիվ փորձարկեցինք GA ազդանշանի արգելակման ազդեցությունը հատուկ IPR-ում: Այդ նպատակով մենք օգտագործեցինք կոթիլեդոնի գավաթ 2 (CUC2) պրոմոութեր՝ ՎԵՆՈՒՍ-ին միաձուլված գերիշխող բացասական gai-1 սպիտակուցի արտահայտման համար (pCUC2::gai-1-VENUS տողում): Վայրի տիպի SAM-ում CUC2 խթանիչը խթանում է IPR-ների մեծ մասի արտահայտումը SAM-ում, ներառյալ սահմանային բջիջները, P4-ից սկսած, և նմանատիպ հատուկ արտահայտություն նկատվել է pCUC2::gai-1-VENUS բույսերում (տես ստորև): Բջիջների բաժանման անկյունների բաշխումը pCUC2::gai-1-VENUS բույսերի SAM կամ IPR-ի վրա էականորեն տարբեր չէր վայրի տիպի բույսերից, թեև անսպասելիորեն մենք գտանք, որ այս բույսերում IPR չունեցող բջիջները բաժանվում են 80–90° ավելի բարձր հաճախականությամբ (նկ. 6f–j):
Ենթադրվում է, որ բջիջների բաժանման ուղղությունը կախված է SAM-ի երկրաչափությունից, մասնավորապես, հյուսվածքների կորության արդյունքում առաջացած առաձգական սթրեսից46: Հետևաբար, մենք հարցրինք, թե արդյոք SAM-ի ձևը փոխվել է della գլոբալ մուտանտի և pCUC2::gai-1-VENUS բույսերում: Ինչպես նախկինում հաղորդվել է12, della գլոբալ մուտանտի SAM-ի չափն ավելի մեծ էր, քան վայրի տեսակինը (Լրացուցիչ նկար 13a, b, d): CLV3-ի և STM RNA-ի in situ հիբրիդացումը հաստատեց մերիստեմի ընդլայնումը դելլա մուտանտներում և հետագայում ցույց տվեց ցողունային բջիջների խորշի կողային ընդլայնումը (Լրացուցիչ նկար 13e, f, h, i): Այնուամենայնիվ, SAM կորությունը նման էր երկու գենոտիպերում (Լրացուցիչ նկար 13k, m, n, p): Մենք նկատեցինք չափի նման աճ gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della քառապատիկ մուտանտում, առանց կորության փոփոխության՝ համեմատած վայրի տեսակի (Լրացուցիչ նկ. 13c, d, g, j, l, o, p): Բջիջների բաժանման կողմնորոշման հաճախականությունը նույնպես ազդել է դելլա քառապատիկ մուտանտում, բայց ավելի քիչ չափով, քան դելլա մոնոլիտ մուտանտում (Լրացուցիչ նկ. 12d–f): Այս դեղաչափային էֆեկտը կորության վրա ազդեցության բացակայության հետ մեկտեղ ենթադրում է, որ մնացորդային RGL3 ակտիվությունը Della քառապատիկ մուտանտում սահմանափակում է բջիջների բաժանման կողմնորոշման փոփոխությունները, որոնք առաջանում են DELLA ակտիվության կորստի հետևանքով, և որ կողային բջիջների բաժանումների փոփոխությունները տեղի են ունենում ի պատասխան GA ազդանշանային գործունեության փոփոխության, այլ ոչ թե SAM երկրաչափության: Ինչպես նկարագրված է վերևում, CUC2 խթանիչը խթանում է IPR արտահայտությունը SAM-ում՝ սկսած P4-ից (Լրացուցիչ նկ. 14a, b), և ի հակադրություն, pCUC2::gai-1-VENUS SAM-ն ուներ փոքր չափսեր, բայց ավելի բարձր կորություն (Լրացուցիչ նկար 14c–h): pCUC2::gai-1-VENUS SAM մորֆոլոգիայի այս փոփոխությունը կարող է հանգեցնել մեխանիկական սթրեսների տարբեր բաշխման՝ համեմատած վայրի տեսակի հետ, որտեղ բարձր շրջագծային լարումները սկսվում են SAM կենտրոնից ավելի կարճ հեռավորությունից47: Որպես այլընտրանք, pCUC2::gai-1-VENUS SAM մորֆոլոգիայի փոփոխությունները կարող են առաջանալ տրանսգենային էքսպրեսիայի արդյունքում առաջացած տարածաշրջանային մեխանիկական հատկությունների փոփոխություններից48: Երկու դեպքում էլ սա կարող է մասամբ փոխհատուցել GA ազդանշանային փոփոխությունների ազդեցությունը՝ մեծացնելով շրջագծային/լայնակի կողմնորոշմամբ բջիջների բաժանման հավանականությունը՝ բացատրելով մեր դիտարկումները:
Միասին մեր տվյալները հաստատում են, որ ավելի բարձր GA ազդանշանն ակտիվ դեր է խաղում IPR-ում բջիջների բաժանման հարթության կողային կողմնորոշման մեջ: Նրանք նաև ցույց են տալիս, որ մերիստեմի կորությունը նույնպես ազդում է IPR-ում բջիջների բաժանման հարթության կողմնորոշման վրա:
IPR-ում բաժանման հարթության լայնակի կողմնորոշումը, GA ազդանշանային բարձր ակտիվության պատճառով, հուշում է, որ GA-ն նախօրոք կազմակերպում է ճառագայթային բջիջների ֆայլ էպիդերմիսում SAM-ի ներսում՝ սահմանելու բջջային կազմակերպությունը, որը հետագայում կհայտնաբերվի էպիդերմիսի միջհանգույցում: Իրոք, նման բջջային ֆայլերը հաճախ տեսանելի էին della գլոբալ մուտանտների SAM պատկերներում (նկ. 6b): Այսպիսով, SAM-ում GA ազդանշանի տարածական օրինաչափության զարգացման գործառույթը հետագայում ուսումնասիրելու համար մենք օգտագործեցինք ժամանակային պատկերացում՝ IPR-ում բջիջների տարածական կազմակերպումը վերլուծելու վայրի տիպի (Ler և Col-0), della գլոբալ մուտանտների և pCUC2::gai-1-VENUS տրանսգենային բույսերում:
Մենք գտանք, որ qmRGA-ն ցույց է տվել, որ GA ազդանշանային ակտիվությունը IPR-ում աճել է P1/P2-ից և հասել է առավելագույնի P4-ում, և այս օրինաչափությունը ժամանակի ընթացքում մնացել է անփոփոխ (նկ. 4a–f և լրացուցիչ նկ. 8c–f, k): IPR-ում բջիջների տարածական կազմակերպումը GA ազդանշանով վերլուծելու համար մենք պիտակավորեցինք Ler IPR բջիջները P4-ի վերևում և կողքերում՝ համաձայն դրանց զարգացման ճակատագրի, որը վերլուծվել է առաջին դիտարկումից 34 ժամ հետո, այսինքն՝ ավելի քան երկու պլաստիդ անգամ, ինչը թույլ է տալիս մեզ հետևել IPR բջիջներին P1/P2-ից P4-ի զարգացման ընթացքում: Մենք օգտագործեցինք երեք տարբեր գույներ՝ դեղին այն բջիջների համար, որոնք ինտեգրված էին P4-ի մոտ պրիմորդիումի մեջ, կանաչ նրանց համար, որոնք գտնվում էին IPR-ում և մանուշակագույն նրանց համար, ովքեր մասնակցում էին երկու գործընթացներին (նկ. 7a–c): t0-ում (0 ժ) P4-ի դիմաց տեսանելի էին IPR բջիջների 1-2 շերտ (նկ. 7ա): Ինչպես և սպասվում էր, երբ այս բջիջները բաժանվեցին, նրանք դա արեցին հիմնականում լայնակի բաժանման հարթության միջոցով (նկ. 7a–c): Նմանատիպ արդյունքներ են ստացվել Col-0 SAM-ի միջոցով (կենտրոնանալով P3-ի վրա, որի եզրագիծը ծալվում է Լեռի P4-ի նման), թեև այս գենոտիպում ծաղկային եզրագծում ձևավորված ծալքը ավելի արագ թաքցնում է IPR բջիջները (նկ. 7g–i): Այսպիսով, IPR բջիջների բաժանման օրինաչափությունը նախապես կազմակերպում է բջիջները ճառագայթային շարքերի, ինչպես միջհանգույցներում: Ճառագայթային շարքերի կազմակերպումը և IPR բջիջների տեղայնացումը հաջորդական օրգանների միջև ենթադրում են, որ այդ բջիջները միջնոդալ նախադրյալներ են:
Այստեղ մենք մշակել ենք GA ազդանշանային բիոսենսոր՝ qmRGA, որը թույլ է տալիս քանակական քարտեզագրել GA ազդանշանային ակտիվությունը, որը բխում է GA և GA ընկալիչների համակցված կոնցենտրացիաներից՝ նվազագույնի հասցնելով միջամտությունը էնդոգեն ազդանշանային ուղիներին, այդպիսով տեղեկատվություն տրամադրելով GA ֆունկցիայի մասին բջջային մակարդակում: Այդ նպատակով մենք կառուցեցինք փոփոխված DELLA սպիտակուց՝ mRGA, որը կորցրել է DELLA-ի փոխազդեցության գործընկերներին կապելու ունակությունը, սակայն զգայուն է մնում GA-ով առաջացած պրոտեոլիզի նկատմամբ: qmRGA-ն արձագանքում է GA մակարդակների ինչպես էկզոգեն, այնպես էլ էնդոգեն փոփոխություններին, և դրա դինամիկ զգայական հատկությունները հնարավորություն են տալիս գնահատել GA ազդանշանային ակտիվության տարածական փոփոխությունները զարգացման ընթացքում: qmRGA-ն նաև շատ ճկուն գործիք է, քանի որ այն կարող է հարմարեցվել տարբեր հյուսվածքներին՝ փոխելով դրա արտահայտման համար օգտագործվող խթանիչը (անհրաժեշտության դեպքում), և հաշվի առնելով GA ազդանշանային ուղու պահպանված բնույթը և անգիոսպերմերի միջով PFYRE մոտիվը, հավանական է, որ այն փոխանցելի լինի այլ տեսակների22: Համապատասխանաբար, բրնձի SLR1 DELLA սպիտակուցի (HYY497AAA) համարժեք մուտացիան նույնպես ցույց է տվել, որ ճնշում է SLR1-ի աճի ռեպրեսորային ակտիվությունը՝ միևնույն ժամանակ մի փոքր նվազեցնելով նրա GA միջնորդավորված դեգրադացիան, որը նման է mRGA23-ին: Հատկանշական է, որ Arabidopsis-ի վերջին ուսումնասիրությունները ցույց են տվել, որ մեկ ամինաթթվի մուտացիան PFYRE տիրույթում (S474L) փոխել է RGA-ի տրանսկրիպցիոն ակտիվությունը՝ չազդելով տրանսկրիպցիոն գործոնի գործընկերների հետ փոխազդելու նրա կարողության վրա50: Թեև այս մուտացիան շատ մոտ է mRGA-ում առկա 3 ամինաթթուների փոխարինմանը, մեր ուսումնասիրությունները ցույց են տալիս, որ այս երկու մուտացիան փոխում է DELLA-ի հստակ բնութագրերը: Չնայած տրանսկրիպցիոն գործոնի գործընկերների մեծ մասը կապվում է DELLA26,51-ի LHR1 և SAW տիրույթներին, որոշ պահպանված ամինաթթուներ PFYRE տիրույթում կարող են օգնել կայունացնել այդ փոխազդեցությունները:
Միջհանգույցների զարգացումը բույսերի ճարտարապետության և բերքատվության բարելավման հիմնական հատկանիշն է: qmRGA-ն բացահայտեց ավելի բարձր GA ազդանշանային ակտիվություն IPR միջհանգույցի նախածննդյան բջիջներում: Համատեղելով քանակական պատկերազարդումը և գենետիկան՝ մենք ցույց տվեցինք, որ GA ազդանշանային օրինաչափությունները գերադասում են SAM էպիդերմիսում բջիջների բաժանման շրջանաձև/լայնակի հարթությունները՝ ձևավորելով բջիջների բաժանման կազմակերպությունը, որն անհրաժեշտ է միջհանգույցների զարգացման համար: Մշակման ընթացքում հայտնաբերվել են բջիջների բաժանման հարթության կողմնորոշման մի քանի կարգավորիչներ52,53: Մեր աշխատանքը հստակ օրինակ է տալիս, թե ինչպես է GA ազդանշանային ակտիվությունը կարգավորում այս բջջային պարամետրը: DELLA-ն կարող է փոխազդել նախածալվող սպիտակուցային համալիրների հետ41, ուստի GA ազդանշանը կարող է կարգավորել բջիջների բաժանման հարթության կողմնորոշումը` ուղղակիորեն ազդելով կեղևային միկրոխողովակների կողմնորոշման վրա40,41,54,55: Մենք անսպասելիորեն ցույց տվեցինք, որ SAM-ում ավելի բարձր GA ազդանշանային ակտիվության հարաբերակցությունը ոչ թե բջիջների երկարացումն ու բաժանումն էր, այլ միայն աճի անիզոտրոպիան, որը համապատասխանում է GA-ի ուղղակի ազդեցությանը IPR-ում բջիջների բաժանման ուղղությամբ: Այնուամենայնիվ, մենք չենք կարող բացառել, որ այս ազդեցությունը կարող է լինել նաև անուղղակի, օրինակ՝ միջնորդավորված GA-ով առաջացած բջջային պատի փափկմամբ56: Բջջային պատի հատկությունների փոփոխությունները առաջացնում են մեխանիկական սթրես57,58, որը կարող է նաև ազդել բջիջների բաժանման հարթության կողմնորոշման վրա՝ ազդելով կեղևային միկրոխողովակների կողմնորոշման վրա39,46,59: GA-ով առաջացած մեխանիկական սթրեսի և GA-ի կողմից միկրոխողովակային կողմնորոշման ուղղակի կարգավորումը կարող է ներգրավվել ՄՍՀ-ում բջիջների բաժանման կողմնորոշման հատուկ օրինաչափության ստեղծման մեջ՝ միջհանգույցները սահմանելու համար, և այս գաղափարը ստուգելու համար անհրաժեշտ են հետագա ուսումնասիրություններ: Նմանապես, նախորդ ուսումնասիրությունները ընդգծեցին DELLA-ի հետ փոխազդող TCP14 և 15 սպիտակուցների կարևորությունը միջհանգույցների ձևավորման վերահսկման մեջ60,61 և այդ գործոնները կարող են միջնորդել GA-ի գործողությունը BREVIPEDICELLUS (BP) և PENNYWISE (PNY) հետ միասին, որոնք կարգավորում են միջհանգույցների զարգացումը և ցույց են տվել, որ ազդում են GA2-ի վրա: Հաշվի առնելով, որ DELLA-ները փոխազդում են բրասինոստերոիդների, էթիլենի, հասմոնաթթվի և աբսիցինաթթվի (ABA) ազդանշանային ուղիների հետ63,64 և որ այդ հորմոնները կարող են ազդել միկրոխողովակների կողմնորոշման վրա65, GA-ի ազդեցությունը բջիջների բաժանման կողմնորոշման վրա կարող է նաև միջնորդավորված լինել այլ հորմոնների կողմից:
Վաղ բջջաբանական ուսումնասիրությունները ցույց են տվել, որ Արաբիդոպսիս ՍԱՄ-ի և՛ ներքին, և՛ արտաքին շրջանները անհրաժեշտ են միջհանգույցների զարգացման համար2,42: Այն փաստը, որ GA-ն ակտիվորեն կարգավորում է բջիջների բաժանումը ներքին հյուսվածքներում12, աջակցում է GA-ի երկակի ֆունկցիան SAM-ում մերիստեմի և միջհանգույցի չափը կարգավորելու գործում: Ուղղորդված բջիջների բաժանման օրինաչափությունը նույնպես սերտորեն կարգավորվում է ներքին SAM հյուսվածքում, և այս կարգավորումը էական է ցողունի աճի համար52: Հետաքրքիր կլինի ուսումնասիրել, թե արդյոք GA-ն նաև դեր է խաղում բջիջների բաժանման հարթությունը ներքին SAM կազմակերպությունում կողմնորոշելու հարցում՝ դրանով իսկ համաժամացնելով միջհանգույցների ճշգրտումն ու զարգացումը SAM-ի ներսում:
Բույսերն աճեցվել են in vitro հողում կամ 1x Murashige-Skoog (MS) միջավայրում (Duchefa), որը լրացվել է 1% սախարոզով և 1% ագարով (Sigma) ստանդարտ պայմաններում (16 ժամ լույս, 22 °C), բացառությամբ հիպոկոտիլային և արմատային աճի փորձերի, որոնցում սածիլները աճեցվել են ուղղահայաց թիթեղների վրա՝ 22 °C մշտական ​​լույսի ներքո: Նիտրատային փորձերի համար բույսերը աճեցվել են փոփոխված MS միջավայրի վրա (bioWORLD բուսական միջավայր), որը լրացվել է համապատասխան նիտրատով (0 կամ 10 մՄ KNO3), 0,5 մՄ NH4-սուկցինատ, 1% սախարոզա և 1% A-ագար (Սիգմա) երկար օրվա պայմաններում:
pDONR221-ի մեջ տեղադրված GID1a cDNA-ն վերամիավորվել է pDONR P4-P1R-pUBQ10-ի և pDONR P2R-P3-mCherry-ի հետ pB7m34GW-ում՝ pUBQ10::GID1a-mCherry-ի մեջ առաջացնելու համար: IDD2 ԴՆԹ-ն, որը տեղադրված է pDONR221-ի մեջ, վերամիավորվել է pB7RWG266-ում՝ ստեղծելով p35S:IDD2-RFP: pGID1b::2xmTQ2-GID1b առաջացնելու համար 3,9 կբ բեկորը GID1b կոդավորման շրջանից վերև և 4,7 կբ բեկոր, որը պարունակում է GID1b cDNA (1,3 կբ) և տերմինատոր (3,4 կբ) նախ ուժեղացվել են՝ օգտագործելով պրայմերները Լրացուցիչ Աղյուսակում, այնուհետև PRmoRmo-ն 3-ում ներառված է: Fisher Scientific) և pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific), համապատասխանաբար, և վերջապես վերամիավորվել pDONR221 2xmTQ268-ի հետ pGreen 012567 թիրախային վեկտորի մեջ՝ օգտագործելով Gateway կլոնավորում: pCUC2::LSSmOrange ստեղծելու համար CUC2 պրոմոտորի հաջորդականությունը (3229 bp ATG-ից վերև), որին հաջորդում է մեծ Stokes-ով տեղափոխված mOrange-ի (LSSmOrange)69 կոդավորման հաջորդականությունը N7 միջուկային տեղայնացման ազդանշանով և NOS տրանսկրիպցիոն տերմինատորը հավաքվել է G-ի թիրախային միջոցի միջոցով: 3-բեկորային ռեկոմբինացիոն համակարգ (Invitrogen): Բուսական երկուական վեկտորը ներմուծվել է Agrobacterium tumefaciens շտամ GV3101 և ներմուծվել Nicotiana benthamiana տերևների մեջ Agrobacterium ինֆիլտրացիայի մեթոդով և Arabidopsis thaliana Col-0՝ համապատասխանաբար ծաղկային թաթախման մեթոդով: pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry և pCLV3::mCherry-NLS qmRGA առանձնացվել են համապատասխան խաչերի F3 և F1 սերունդներից համապատասխանաբար:
ՌՆԹ in situ հիբրիդացումն իրականացվել է մոտավորապես 1 սմ երկարությամբ ընձյուղների վրա72, որոնք հավաքվել և անմիջապես ամրացվել են FAA լուծույթում (3,7% ֆորմալդեհիդ, 5% քացախաթթու, 50% էթանոլ) նախապես սառեցված մինչև 4 °C: 2 × 15 րոպե վակուումային բուժումից հետո ֆիքսատորը փոխվել է և նմուշները ինկուբացվել են գիշերում: GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2 և RGL3 cDNA-ները և հակազգայուն զոնդերը իրենց 3'-UTR-ների համար սինթեզվել են՝ օգտագործելով Լրացուցիչ Աղյուսակ 3-ում ներկայացված պրայմերները, ինչպես նկարագրված է Rosier et al.73-ի կողմից: Դիգօքսիգենինով պիտակավորված զոնդերը իմունային հայտնաբերվեցին՝ օգտագործելով դիգոքսիգենին հակամարմիններ (3000 անգամ նոսրացում; Roche, կատալոգի համարը՝ 11 093 274 910), և հատվածները ներկվեցին 5-բրոմո-4-քլորո-3-ինդոլիլ ֆոսֆատով (BCIP, 00000000) (NBT, 200 անգամ նոսրացում) լուծույթ։