Առևտրային ցիպերմետրինի պատրաստուկների մահացությունը և թունավորությունը փոքր ջրային գորտնուկների համար

Այս ուսումնասիրությունը գնահատել է առևտրային դեղերի մահացուությունը, ենթամահացուությունը և թունավորությունը։ցիպերմետրինանուրանային գորտնուկների վրա բանաձևերի կիրառումը: Սուր փորձարկման ժամանակ 96 ժամվա ընթացքում փորձարկվել են 100–800 մկգ/լ կոնցենտրացիաներ: Քրոնիկ փորձարկման ժամանակ մահացության համար ստուգվել են բնականորեն առաջացող ցիպերմետրինի կոնցենտրացիաները (1, 3, 6 և 20 մկգ/լ), որին հաջորդել է միկրոմիջուկային թեստավորումը և էրիթրոցիտների միջուկային անոմալիաների ուսումնասիրությունը 7 օրվա ընթացքում: Առևտրային ցիպերմետրինի բանաձևի LC50-ն գորտնուկների համար կազմել է 273.41 մկգ L−1: Քրոնիկ փորձարկման ժամանակ ամենաբարձր կոնցենտրացիան (20 մկգ L−1) հանգեցրել է 50%-ից ավելի մահացության, քանի որ այն սպանել է փորձարկված գորտնուկների կեսին: Միկրոմիջուկային թեստը ցույց է տվել նշանակալի արդյունքներ 6 և 20 մկգ L−1 կոնցենտրացիաներով, և հայտնաբերվել են մի քանի միջուկային անոմալիաներ, ինչը ցույց է տալիս, որ առևտրային ցիպերմետրինի բանաձևն ունի գենոտոքսիկ ներուժ P. gracilis-ի դեմ: Ցիպերմետրինը բարձր ռիսկ է ներկայացնում այս տեսակի համար, ինչը ցույց է տալիս, որ այն կարող է բազմաթիվ խնդիրներ առաջացնել և ազդել այս էկոհամակարգի դինամիկայի վրա կարճաժամկետ և երկարաժամկետ հեռանկարում: Հետևաբար, կարելի է եզրակացնել, որ ցիպերմետրինի առևտրային բանաձևերը թունավոր ազդեցություն ունեն P. gracilis-ի վրա:
Գյուղատնտեսական գործունեության շարունակական ընդլայնման և ինտենսիվ կիրառման շնորհիվվնասատուների դեմ պայքարմիջոցառումների շնորհիվ ջրային կենդանիները հաճախ ենթարկվում են թունաքիմիկատների ազդեցության1,2: Գյուղատնտեսական դաշտերի մոտ գտնվող ջրային ռեսուրսների աղտոտումը կարող է ազդել ոչ թիրախային օրգանիզմների, ինչպիսիք են երկկենցաղները, զարգացման և գոյատևման վրա:
Երկկենցաղները գնալով ավելի կարևոր են դառնում շրջակա միջավայրի մատրիցների գնահատման մեջ: Անուրանները համարվում են շրջակա միջավայրի աղտոտիչների լավ բիոլոգիական ցուցիչներ՝ իրենց յուրահատուկ բնութագրերի շնորհիվ, ինչպիսիք են բարդ կյանքի ցիկլերը, թրթուրների արագ աճի տեմպերը, տրոֆիկ կարգավիճակը, թափանցելի մաշկը10,11, ջրից կախվածությունը վերարտադրության համար12 և չպաշտպանված ձվերը11,13,14: Փոքրիկ ջրային գորտը (Physalaemus gracilis), որը հայտնի է որպես լացող գորտ, ցույց է տրվել, որ թունաքիմիկատներով աղտոտման բիոլոգիական ցուցիչ տեսակ է4,5,6,7,15: Այս տեսակը հանդիպում է Արգենտինայի, Ուրուգվայի, Պարագվայի և Բրազիլիայի կանգնած ջրերում, պահպանվող տարածքներում կամ փոփոխական բնակավայրերով տարածքներում1617 և IUCN դասակարգմամբ համարվում է կայուն՝ իր լայն տարածման և տարբեր բնակավայրերի նկատմամբ հանդուրժողականության շնորհիվ18:
Երկկենցաղների մոտ ցիպերմետրինի ազդեցությանը ենթարկվելուց հետո հաղորդվել է ենթամահացու ազդեցությունների մասին, այդ թվում՝ գորտնուկների վարքային, ձևաբանական և կենսաքիմիական փոփոխություններ23,24,25, մահացության և մետամորֆոզի ժամանակի փոփոխություն, ֆերմենտատիվ փոփոխություններ, ձվից դուրս գալու հաջողության նվազում24,25, գերակտիվություն26, խոլինէսթերազի ակտիվության արգելակում27 և լողի կատարողականի փոփոխություններ7,28: Այնուամենայնիվ, երկկենցաղների վրա ցիպերմետրինի գենոտոքսիկ ազդեցության ուսումնասիրությունները սահմանափակ են: Հետևաբար, կարևոր է գնահատել անուրան տեսակների զգայունությունը ցիպերմետրինի նկատմամբ:
Շրջակա միջավայրի աղտոտումը ազդում է երկկենցաղների բնականոն աճի և զարգացման վրա, սակայն ամենալուրջ բացասական ազդեցությունը ԴՆԹ-ի գենետիկական վնասն է, որը առաջանում է թունաքիմիկատների ազդեցության հետևանքով13: Արյան բջիջների ձևաբանության վերլուծությունը աղտոտվածության և վայրի տեսակների համար նյութի պոտենցիալ թունավորության կարևոր բիոլոգիական ցուցիչ է29: Միկրոկորիզային թեստը շրջակա միջավայրում քիմիական նյութերի գենոտոքսիկությունը որոշելու ամենատարածված մեթոդներից մեկն է30: Այն արագ, արդյունավետ և էժան մեթոդ է, որը լավ ցուցիչ է օրգանիզմների, ինչպիսիք են երկկենցաղները31,32, քիմիական աղտոտվածության և կարող է տեղեկատվություն տրամադրել գենոտոքսիկ աղտոտիչների ազդեցության վերաբերյալ33:
Այս ուսումնասիրության նպատակն էր գնահատել առևտրային ցիպերմետրինի բանաձևերի թունավոր ներուժը փոքր ջրային գորտնուկների համար՝ օգտագործելով միկրոմիջուկային թեստ և էկոլոգիական ռիսկի գնահատում։
Փորձարկման սուր ժամանակահատվածում առևտրային ցիպերմետրինի տարբեր կոնցենտրացիաների ազդեցությանը ենթարկված P. gracilis գորտնուկների կուտակային մահացությունը (%)։
Քրոնիկական փորձարկման ընթացքում առևտրային ցիպերմետրինի տարբեր կոնցենտրացիաների ազդեցությանը ենթարկված P. gracilis գորտնուկների կուտակային մահացությունը (%)։
Դիտարկված բարձր մահացությունը ցիպերմետրինի տարբեր կոնցենտրացիաներին (6 և 20 մկգ/լ) ենթարկված երկկենցաղների մոտ գենոտոքսիկ ազդեցությունների արդյունք էր, ինչի մասին վկայում են միկրոկորիզների (ՄԿ) առկայությունը և էրիթրոցիտներում միջուկային անոմալիաները: ՄԿ-ի առաջացումը վկայում է միտոզի սխալների մասին և կապված է քրոմոսոմների միկրոխողովակներին վատ կապի, քրոմոսոմների կլանման և տեղափոխման համար պատասխանատու սպիտակուցային համալիրների արատների, քրոմոսոմների տարանջատման սխալների և ԴՆԹ-ի վնասման վերականգնման սխալների հետ38,39 և կարող է կապված լինել թունաքիմիկատների առաջացրած օքսիդատիվ սթրեսի հետ40,41: Գնահատված բոլոր կոնցենտրացիաներում դիտվել են այլ անոմալիաներ: Ցիպերմետրինի կոնցենտրացիաների աճը էրիթրոցիտներում միջուկային անոմալիաները համապատասխանաբար 5%-ով և 20%-ով մեծացրել է ամենացածր (1 մկգ/լ) և ամենաբարձր (20 մկգ/լ) դեղաչափերի դեպքում: Օրինակ, տեսակի ԴՆԹ-ի փոփոխությունները կարող են լուրջ հետևանքներ ունենալ ինչպես կարճաժամկետ, այնպես էլ երկարաժամկետ գոյատևման համար, ինչը հանգեցնում է պոպուլյացիայի նվազմանը, վերարտադրողական պիտանիության փոփոխությանը, արյունակցական կապերին, գենետիկական բազմազանության կորստին և միգրացիայի տեմպերի փոփոխությանը: Այս բոլոր գործոնները կարող են ազդել տեսակների գոյատևման և պահպանման վրա42,43: Էրիթրոիդային անոմալիաների առաջացումը կարող է վկայել ցիտոկինեզի խցանման մասին, ինչը հանգեցնում է բջջային աննորմալ բաժանման (երկմիջուկանի էրիթրոցիտներ)44,45։ Բազմաբլթակ կորիզները միջուկային թաղանթի ելուստներ են՝ բազմաթիվ բլթակներով46, մինչդեռ այլ էրիթրոիդային անոմալիաներ կարող են կապված լինել ԴՆԹ-ի ամպլիֆիկացիայի հետ, ինչպիսիք են միջուկային երիկամները/բշտիկները47։ Առանց միջուկի էրիթրոցիտների առկայությունը կարող է վկայել թթվածնի փոխադրման խանգարման մասին, հատկապես աղտոտված ջրում48,49։ Ապոպտոզը վկայում է բջջային մահվան մասին50։
Այլ ուսումնասիրություններ նույնպես ցույց են տվել ցիպերմետրինի գենոտոքսիկ ազդեցությունը: Կաբանյան և այլք51 ցույց են տվել միկրոկորիզների և միջուկային փոփոխությունների առկայությունը, ինչպիսիք են երկմիջուկ բջիջները և ապոպտոզ բջիջները Odontophrynus americanus բջիջներում՝ ցիպերմետրինի բարձր կոնցենտրացիաների (5000 և 10,000 մկգ L−1) 96 ժամ ազդեցության ենթարկվելուց հետո: Ցիպերմետրինով առաջացած ապոպտոզը հայտնաբերվել է նաև P. biligonigerus52 և Rhinella arenarum53 տեսակների մոտ: Այս արդյունքները ենթադրում են, որ ցիպերմետրինը գենոտոքսիկ ազդեցություն ունի ջրային մի շարք օրգանիզմների վրա, և որ MN և ENA անալիզները կարող են լինել երկկենցաղների վրա ենթամահացու ազդեցության ցուցիչ և կարող են կիրառելի լինել թունավոր նյութերի ազդեցությանը ենթարկված տեղական տեսակների և վայրի պոպուլյացիաների համար12:
Ցիպերմետրինի առևտրային բանաձևերը ներկայացնում են բարձր բնապահպանական վտանգ (թե՛ սուր, թե՛ քրոնիկ), որտեղ HQ-ները գերազանցում են ԱՄՆ շրջակա միջավայրի պաշտպանության գործակալության (EPA) մակարդակը54, որը կարող է բացասաբար ազդել տեսակի վրա, եթե այն առկա է շրջակա միջավայրում: Քրոնիկ ռիսկի գնահատման ժամանակ մահացության NOEC-ը կազմել է 3 մկգ L−1, ինչը հաստատում է, որ ջրում հայտնաբերված կոնցենտրացիաները կարող են վտանգ ներկայացնել տեսակի համար55: Էնդոսուլֆանի և ցիպերմետրինի խառնուրդին ենթարկված R. arenarum թրթուրների համար մահացու NOEC-ը կազմել է 500 մկգ L−1 168 ժամ անց. այս արժեքը նվազել է մինչև 0.0005 մկգ L−1 336 ժամ անց: Հեղինակները ցույց են տալիս, որ որքան երկար է ազդեցությունը, այնքան ցածր են տեսակի համար վնասակար կոնցենտրացիաները: Կարևոր է նաև ընդգծել, որ NOEC արժեքները նույն ազդեցության ժամանակ ավելի բարձր էին, քան P. gracilis-ինը, ինչը ցույց է տալիս, որ տեսակի արձագանքը ցիպերմետրինին բնորոշ է տեսակային: Ավելին, մահացության առումով, ցիպերմետրինի ազդեցությունից հետո P. gracilis-ի CHQ արժեքը հասել է 64.67-ի, որը բարձր է ԱՄՆ շրջակա միջավայրի պաշտպանության գործակալության կողմից սահմանված հղման արժեքից54, իսկ R. arenarum թրթուրների CHQ արժեքը նույնպես բարձր է եղել այս արժեքից (CHQ > 388.00 336 ժամ հետո), ինչը ցույց է տալիս, որ ուսումնասիրված միջատասպանները բարձր ռիսկ են ներկայացնում մի քանի երկկենցաղների տեսակների համար: Հաշվի առնելով, որ P. gracilis-ին անհրաժեշտ է մոտավորապես 30 օր մետամորֆոզն ավարտելու համար56, կարելի է եզրակացնել, որ ցիպերմետրինի ուսումնասիրված կոնցենտրացիաները կարող են նպաստել պոպուլյացիայի նվազմանը՝ կանխելով վարակված անհատների վաղ տարիքում հասունության կամ վերարտադրողական փուլ մտնելը:
Միկրոկորիզների և էրիթրոցիտների միջուկային այլ անոմալիաների հաշվարկված ռիսկի գնահատման ժամանակ CHQ արժեքները տատանվել են 14.92-ից մինչև 97.00, ինչը ցույց է տալիս, որ ցիպերմետրինը P. gracilis-ի համար ունի գենոտոքսիկ պոտենցիալ ռիսկ նույնիսկ դրա բնական միջավայրում: Հաշվի առնելով մահացությունը՝ քսենոբիոտիկ միացությունների առավելագույն կոնցենտրացիան, որը կարող է հանդուրժվել P. gracilis-ի համար, կազմել է 4.24 մկգ/լ: Այնուամենայնիվ, 1 մկգ/լ-ից ցածր կոնցենտրացիաները նույնպես ցույց են տվել գենոտոքսիկ ազդեցություն: Այս փաստը կարող է հանգեցնել աննորմալ անհատների թվի աճի57 և ազդել տեսակների զարգացման և վերարտադրության վրա դրանց միջավայրերում, ինչը հանգեցնում է երկկենցաղների պոպուլյացիաների նվազմանը:
Ցիպերմետրին միջատասպանի առևտրային բանաձևերը ցույց տվեցին բարձր սուր և քրոնիկ թունավորություն P. gracilis-ի նկատմամբ: Նկատվել են ավելի բարձր մահացության ցուցանիշներ, հավանաբար թունավոր ազդեցությունների պատճառով, ինչը վկայում է միկրոկորիզների և էրիթրոցիտների միջուկային անոմալիաների առկայությունը, մասնավորապես՝ ատամնավոր կորիզների, բլթակավոր կորիզների և վեզիկուլյար կորիզների: Բացի այդ, ուսումնասիրված տեսակները ցույց տվեցին շրջակա միջավայրի ռիսկերի աճ՝ թե՛ սուր, թե՛ քրոնիկ: Այս տվյալները, մեր հետազոտական ​​խմբի կողմից անցկացված նախորդ ուսումնասիրությունների հետ համատեղ, ցույց տվեցին, որ նույնիսկ ցիպերմետրինի տարբեր առևտրային բանաձևերը դեռևս առաջացնում են ացետիլխոլինէսթերազի (AChE) և բուտիրիլխոլինէսթերազի (BChE) ակտիվության նվազում և օքսիդատիվ սթրես58, և հանգեցրել են լողի ակտիվության փոփոխությունների և բերանի խոռոչի արատների59 P. gracilis-ի մոտ, ինչը ցույց է տալիս, որ ցիպերմետրինի առևտրային բանաձևերը ունեն բարձր մահացու և ենթամահացու թունավորություն այս տեսակի համար: Հարթմանը և այլք60 պարզել են, որ ցիպերմետրինի առևտրային բանաձևերը ամենաթունավորն էին P. gracilis-ի և նույն ցեղի մեկ այլ տեսակի (P. cuvieri) համար՝ համեմատած ինը այլ թունաքիմիկատների հետ: Սա ենթադրում է, որ ցիպերմետրինի շրջակա միջավայրի պաշտպանության համար օրենքով հաստատված կոնցենտրացիաները կարող են հանգեցնել բարձր մահացության և երկարաժամկետ հեռանկարում պոպուլյացիայի նվազման։
Երկկենցաղների համար թունաքիմիկատների թունավորությունը գնահատելու համար անհրաժեշտ են հետագա ուսումնասիրություններ, քանի որ շրջակա միջավայրում հայտնաբերված կոնցենտրացիաները կարող են բարձր մահացության պատճառ դառնալ և պոտենցիալ վտանգ ներկայացնել P. gracilis-ի համար: Պետք է խրախուսել երկկենցաղների տեսակների վերաբերյալ հետազոտությունները, քանի որ այս օրգանիզմների վերաբերյալ տվյալները սակավ են, մասնավորապես՝ բրազիլական տեսակների վերաբերյալ:
Քրոնիկ թունավորության թեստը տևել է 168 ժամ (7 օր) ստատիկ պայմաններում, և ենթամահացու կոնցենտրացիաները կազմել են՝ 1, 3, 6 և 20 մկգ ai L−1: Երկու փորձերի ժամանակ էլ յուրաքանչյուր մշակման խմբում գնահատվել է 10 գորտուկ՝ վեց կրկնությամբ, ընդհանուր առմամբ 60 գորտուկ մեկ կոնցենտրացիայի համար: Միևնույն ժամանակ, միայն ջրով մշակումը ծառայել է որպես բացասական վերահսկողություն: Յուրաքանչյուր փորձարարական կառուցվածք բաղկացած էր ստերիլ ապակե ամանից՝ 500 մլ տարողությամբ և 50 մլ լուծույթի վրա 1 գորտուկ խտությամբ: Սալոնը ծածկված էր պոլիէթիլենային թաղանթով՝ գոլորշիացումը կանխելու համար և անընդհատ օդափոխվում էր:
Ջուրը քիմիական վերլուծության է ենթարկվել՝ 0, 96 և 168 ժամվա ընթացքում թունաքիմիկատների կոնցենտրացիաները որոշելու համար: Սաբինի և այլոց68 և Մարտինսի և այլոց69 համաձայն, վերլուծությունները կատարվել են Սանտա Մարիայի դաշնային համալսարանի թունաքիմիկատների վերլուծության լաբորատորիայում (LARP)՝ օգտագործելով գազային քրոմատոգրաֆիա՝ զուգակցված եռակի քառաբևեռ զանգվածային սպեկտրոմետրիայի հետ (Varian մոդել 1200, Պալո Ալտո, Կալիֆոռնիա, ԱՄՆ): Ջրում թունաքիմիկատների քանակական որոշումը ներկայացված է որպես լրացուցիչ նյութ (աղյուսակ SM1):
Միկրոկորիզային թեստի (MNT) և կարմիր բջիջների միջուկային անոմալիայի թեստի (RNA) համար վերլուծվել են յուրաքանչյուր բուժական խմբի 15 գորտուկներ: Գորտուկները անզգայացվել են 5% լիդոկաինով (50 մգ գ-170), իսկ արյան նմուշները հավաքվել են սրտի պունկցիայի միջոցով՝ օգտագործելով միանգամյա օգտագործման հեպարինացված ներարկիչներ: Արյան քսուքները պատրաստվել են ստերիլ մանրադիտակային սլայդների վրա, չորացվել են օդում, ֆիքսվել են 100% մեթանոլով (4 °C) 2 րոպե, ապա ներկվել են 10% Գիմզայի լուծույթով 15 րոպե մթության մեջ: Գործընթացի ավարտին սլայդները լվացվել են թորած ջրով՝ ավելորդ ներկը հեռացնելու համար և չորացվել են սենյակային ջերմաստիճանում:
Յուրաքանչյուր շերեփուկից վերցված առնվազն 1000 էրիթրոցիտներ վերլուծվել են 100× մանրադիտակի միջոցով՝ 71 օբյեկտիվով՝ MN-ի և ENA-ի առկայությունը որոշելու համար: Շերեփուկներից վերցված ընդհանուր 75,796 էրիթրոցիտներ գնահատվել են՝ հաշվի առնելով ցիպերմետրինի կոնցենտրացիաները և վերահսկիչ խմբերը: Գենոտոքսիկությունը վերլուծվել է Կարասկոյի և այլոց, ինչպես նաև Ֆենեխի և այլոց մեթոդով38,72՝ որոշելով հետևյալ միջուկային վնասվածքների հաճախականությունը. (1) միջուկազուրկ բջիջներ՝ բջիջներ առանց կորիզի; (2) ապոպտոզ բջիջներ՝ միջուկային մասնատում, ծրագրավորված բջջային մահ; (3) երկմիջուկ բջիջներ՝ բջիջներ երկու կորիզով; (4) միջուկային բողբոջներ կամ բշտիկներ՝ բջիջներ, որոնք ունեն միջուկային թաղանթի փոքր ելուստներ, բշտիկներ, որոնք չափերով նման են միկրոկորիզներին; (5) կարիոլիզացված բջիջներ՝ բջիջներ, որոնք ունեն միայն կորիզի ուրվագիծ՝ առանց ներքին նյութի; (6) ատամնավոր բջիջներ՝ բջիջներ, որոնց կորիզները ունեն ակնհայտ ճաքեր կամ կտրվածքներ իրենց ձևով, որոնք կոչվում են նաև երիկամաձև կորիզներ։ (7) լոբուլացված բջիջներ՝ բջիջներ, որոնց միջուկային ելուստները մեծ են վերը նշված վեզիկուլներից, և (8) միկրոբջիջներ՝ բջիջներ, որոնք ունեն խտացված միջուկներ և կրճատված ցիտոպլազմա։ Փոփոխությունները համեմատվել են բացասական վերահսկողության արդյունքների հետ։
Սուր թունավորության թեստի արդյունքները (LC50) վերլուծվել են GBasic ծրագրի և TSK-Trimmed Spearman-Karber մեթոդի74 միջոցով: Քրոնիկ թեստի տվյալները նախնական ստուգվել են սխալի նորմալության (Շապիրո-Վիլքս) և դիսպերսիայի միատարրության (Բարթլետ) համար: Արդյունքները վերլուծվել են միակողմանի դիսպերսիայի վերլուծության (ANOVA) միջոցով: Թյուքիի թեստն օգտագործվել է տվյալները միմյանց միջև համեմատելու համար, իսկ Դաննեթի թեստը՝ բուժման խմբի և բացասական վերահսկիչ խմբի միջև տվյալները համեմատելու համար:
LOEC և NOEC տվյալները վերլուծվել են Դաննեթի թեստի միջոցով: Վիճակագրական թեստերը կատարվել են Statistica 8.0 ծրագրաշարի (StatSoft) միջոցով՝ 95% նշանակալիության մակարդակով (p < 0.05):