Առևտրային ցիպերմետրինի պատրաստուկների մահացությունը և թունավորությունը փոքր ջրային շերեփուկների համար

Այս ուսումնասիրությունը գնահատել է առևտրի մահացությունը, ենթամահաբերությունը և թունավորությունըցիպերմետրինձևակերպումներ անուրան շերեփուկներին. Սուր թեստի ժամանակ 100-800 մկգ/լ կոնցենտրացիաները փորձարկվել են 96 ժամվա ընթացքում: Խրոնիկական թեստի ժամանակ ցիպերմետրինի բնական կոնցենտրացիաները (1, 3, 6 և 20 մկգ/լ) փորձարկվել են մահացության համար, որին հաջորդել են միկրոմիջուկի փորձարկումը և կարմիր արյան բջիջների միջուկային անոմալիաները 7 օրվա ընթացքում: Առևտրային ցիպերմետրինի LC50-ը ​​շերեփուկների համար 273,41 մկգ L−1 էր: Խրոնիկական թեստի ժամանակ ամենաբարձր կոնցենտրացիան (20 μg L−1) հանգեցրեց ավելի քան 50% մահացության, քանի որ այն սպանեց փորձարկված շերեփուկների կեսին: Միկրոմիջուկային թեստը ցույց տվեց զգալի արդյունքներ 6 և 20 μg L−1 պարունակությամբ, և հայտնաբերվեցին մի քանի միջուկային անոմալիաներ, ինչը ցույց է տալիս, որ առևտրային ցիպերմետրինի ձևակերպումը գենոտոքսիկ պոտենցիալ ունի P. gracilis-ի նկատմամբ: Ցիպերմետրինը բարձր ռիսկ է այս տեսակի համար, ինչը ցույց է տալիս, որ այն կարող է բազմաթիվ խնդիրներ առաջացնել և ազդել այս էկոհամակարգի դինամիկայի վրա կարճ և երկարաժամկետ հեռանկարում: Հետևաբար, կարելի է եզրակացնել, որ ցիպերմետրինի կոմերցիոն ձևակերպումները թունավոր ազդեցություն ունեն P. gracilis-ի վրա:
Գյուղատնտեսական գործունեության շարունակական ընդլայնման և ինտենսիվ կիրառման շնորհիվվնասատուների դեմ պայքարՋրային կենդանիները հաճախ ենթարկվում են թունաքիմիկատների ազդեցությանը1,2. Գյուղատնտեսական դաշտերի մոտ ջրային ռեսուրսների աղտոտումը կարող է ազդել ոչ թիրախային օրգանիզմների զարգացման և գոյատևման վրա, ինչպիսիք են երկկենցաղները:
Երկկենցաղները գնալով ավելի կարևոր են դառնում շրջակա միջավայրի մատրիցների գնահատման հարցում: Անուրանները համարվում են շրջակա միջավայրի աղտոտիչների լավ կենսացուցիչներ՝ շնորհիվ իրենց եզակի բնութագրերի, ինչպիսիք են կյանքի բարդ ցիկլերը, թրթուրների արագ աճի տեմպերը, տրոֆիկ կարգավիճակը, թափանցելի մաշկը10,11, վերարտադրության ջրից կախվածությունը12 և անպաշտպան ձվերը11,13,14: Պարզվել է, որ փոքրիկ ջրային գորտը (Physalaemus gracilis), որը սովորաբար հայտնի է որպես լացող գորտ, հանդիսանում է թունաքիմիկատներով աղտոտվածության կենսացուցանիշ4,5,6,7,15: Տեսակը հանդիպում է Արգենտինայի, Ուրուգվայի, Պարագվայի և Բրազիլիայի կանգուն ջրերում, պահպանվող տարածքներում կամ փոփոխական միջավայրով տարածքներում1617 և ԲՊՄՄ դասակարգմամբ համարվում է կայուն՝ շնորհիվ իր լայն տարածման և տարբեր աճելավայրերի հանդուրժողականության18:
Ցիպերմետրինին ենթարկվելուց հետո երկկենցաղների մոտ նկատվել են ենթամահացու ազդեցություններ, ներառյալ շերեփուկների վարքագծային, ձևաբանական և կենսաքիմիական փոփոխություններ23,24,25, մահացության և կերպարանափոխության ժամանակի փոփոխություն, ֆերմենտային փոփոխություններ, ելքի հաջողության նվազում24,25, հիպերակտիվություն26, 28-ի գործունակության արգելակում27 և 27-ի գործունակության արգելակում: Այնուամենայնիվ, երկկենցաղների վրա ցիպերմետրինի գենոտոքսիկ ազդեցության ուսումնասիրությունները սահմանափակ են: Հետևաբար, կարևոր է գնահատել անուրան տեսակների զգայունությունը ցիպերմետրինի նկատմամբ:
Շրջակա միջավայրի աղտոտվածությունը ազդում է երկկենցաղների բնականոն աճի և զարգացման վրա, սակայն ամենալուրջ անբարենպաստ ազդեցությունը ԴՆԹ-ի գենետիկ վնասն է թունաքիմիկատների ազդեցության հետևանքով13: Արյան բջիջների մորֆոլոգիայի վերլուծությունը աղտոտվածության և վայրի տեսակների համար նյութի պոտենցիալ թունավորության կարևոր կենսացուցիչ է29: Միկրոմիջուկային թեստը շրջակա միջավայրում քիմիական նյութերի գենոտոքսիկությունը որոշելու ամենատարածված մեթոդներից մեկն է30: Այն արագ, արդյունավետ և էժան մեթոդ է, որը լավ ցուցիչ է օրգանիզմների քիմիական աղտոտվածության մասին, ինչպիսիք են երկկենցաղները31,32 և կարող է տեղեկատվություն տրամադրել գենոտոքսիկ աղտոտիչների ազդեցության մասին33:
Այս հետազոտության նպատակն էր գնահատել առևտրային ցիպերմետրինի ձևակերպումների թունավոր պոտենցիալը փոքր ջրային շերեփուկների համար՝ օգտագործելով միկրոմիջուկային թեստ և էկոլոգիական ռիսկի գնահատում:
Թեստավորման սուր ժամանակահատվածում առևտրային ցիպերմետրինի տարբեր կոնցենտրացիաների ենթարկված P. gracilis շերեփուկների կուտակային մահացությունը (%):
Խրոնիկական թեստի ժամանակ առևտրային ցիպերմետրինի տարբեր կոնցենտրացիաների ենթարկված P. gracilis շերեփուկների կուտակային մահացությունը (%):
Դիտարկված բարձր մահացությունը ցիպերմետրինի տարբեր կոնցենտրացիաների (6 և 20 մկգ/լ) ազդեցության ենթարկված երկկենցաղների մոտ գենոտոքսիկ ազդեցության արդյունք էր, ինչի մասին վկայում են միկրոմիջուկների (MN) և էրիթրոցիտներում միջուկային անոմալիաների առկայությունը: MN-ի ձևավորումը ցույց է տալիս միտոզում սխալներ և կապված է քրոմոսոմների վատ կապակցման հետ միկրոխողովակներին, քրոմոսոմների կլանման և տեղափոխման համար պատասխանատու սպիտակուցային համալիրների թերությունների, քրոմոսոմների տարանջատման սխալների և ԴՆԹ-ի վնասների վերականգնման սխալների հետ38,39 և կարող է կապված լինել պեստիցիդներով առաջացած սթրեսի հետ4041: Գնահատված բոլոր կոնցենտրացիաներում նկատվել են այլ աննորմալություններ: Ցիպերմետրինի կոնցենտրացիայի աճը մեծացրեց էրիթրոցիտներում միջուկային անոմալիաները 5% և 20% համապատասխանաբար նվազագույն (1 մկգ/լ) և ամենաբարձր (20 մկգ/լ) դոզաներում: Օրինակ՝ տեսակների ԴՆԹ-ի փոփոխությունները կարող են լուրջ հետևանքներ ունենալ ինչպես կարճաժամկետ, այնպես էլ երկարաժամկետ գոյատևման համար, ինչը կհանգեցնի բնակչության նվազմանը, վերարտադրողականության փոփոխված վիճակին, ներդաշնակությանը, գենետիկական բազմազանության կորստին և միգրացիայի տեմպերի փոփոխմանը: Այս բոլոր գործոնները կարող են ազդել տեսակների գոյատևման և պահպանման վրա42,43: Էրիտրոիդային անոմալիաների ձևավորումը կարող է վկայել ցիտոկինեզի արգելափակման մասին, ինչը հանգեցնում է բջիջների աննորմալ բաժանման (երկմիջուկային էրիթրոցիտներ)44,45; բազմաբլոբ միջուկները միջուկային թաղանթի ելուստներն են բազմաթիվ բլթերով46, մինչդեռ էրիթրոիդային այլ աննորմալություններ կարող են կապված լինել ԴՆԹ-ի ուժեղացման հետ, ինչպիսիք են միջուկային երիկամները/բլթակները47: Անմիջուկային էրիթրոցիտների առկայությունը կարող է վկայել թթվածնի տեղափոխման խանգարման մասին, հատկապես աղտոտված ջրում48,49: Ապոպտոզը ցույց է տալիս բջիջների մահ50:
Այլ հետազոտություններ ցույց են տվել նաև ցիպերմետրինի գենոտոքսիկ ազդեցությունը: Kabaña-ն և այլոք.51-ը ցույց են տվել միկրոմիջուկների և միջուկային փոփոխությունների, ինչպիսիք են երկմիջուկային բջիջները և ապոպտոտիկ բջիջները Odontophrynus americanus բջիջներում 96 ժամվա ընթացքում ցիպերմետրինի բարձր կոնցենտրացիաների (5000 և 10000 μg L−1) ազդեցությունից հետո: Ցիպերմետրինով պայմանավորված ապոպտոզ է հայտնաբերվել նաև P. biligonigerus52 և Rhinella arenarum53 մոտ: Այս արդյունքները ցույց են տալիս, որ ցիպերմետրինը գենոտոքսիկ ազդեցություն ունի մի շարք ջրային օրգանիզմների վրա, և որ MN-ի և ENA-ի վերլուծությունը կարող է լինել երկկենցաղների վրա ենթամահաբեր ազդեցության ցուցիչ և կիրառելի լինել թունավոր նյութերի ազդեցությանը ենթարկված բնիկ տեսակների և վայրի պոպուլյացիաների համար12:
Ցիպերմետրինի առևտրային ձևակերպումները մեծ բնապահպանական վտանգ են ներկայացնում (ինչպես սուր, այնպես էլ քրոնիկ), ընդ որում, շտաբները գերազանցում են ԱՄՆ Շրջակա միջավայրի պաշտպանության գործակալության (EPA) մակարդակը54, ինչը կարող է բացասաբար ազդել տեսակների վրա, եթե առկա է շրջակա միջավայրում: Քրոնիկ ռիսկի գնահատման ժամանակ մահացության NOEC-ը եղել է 3 μg L−1՝ հաստատելով, որ ջրում հայտնաբերված կոնցենտրացիաները կարող են վտանգ ներկայացնել տեսակի համար55: Էնդոսուլֆանի և ցիպերմետրինի խառնուրդի ազդեցության տակ գտնվող R. arenarum թրթուրների համար մահացու NOEC-ը 168 ժամ հետո եղել է 500 μg L−1; այս արժեքը նվազել է մինչև 0,0005 μg L−1 336 ժամ հետո: Հեղինակները ցույց են տալիս, որ որքան երկար է բացահայտումը, այնքան ցածր են տեսակների համար վնասակար կոնցենտրացիաները: Կարևոր է նաև ընդգծել, որ NOEC արժեքներն ավելի բարձր են եղել, քան P. gracilis-ի արժեքները նույն ազդեցության ժամանակ, ինչը ցույց է տալիս, որ տեսակների արձագանքը ցիպերմետրինին հատուկ է տեսակներին: Ավելին, մահացության առումով P. gracilis-ի CHQ արժեքը ցիպերմետրինին ենթարկվելուց հետո հասել է 64,67-ի, ինչը ավելի բարձր է, քան ԱՄՆ Շրջակա միջավայրի պահպանության գործակալության կողմից սահմանված հղման արժեքը54, իսկ R. arenarum larvae-ի CHQ արժեքը նույնպես բարձր է եղել այս արժեքից (CHQ > 3836-ից հետո ուսումնասիրված ցուցանիշը): մեծ վտանգ է ներկայացնում երկկենցաղների մի քանի տեսակների համար: Հաշվի առնելով, որ P. gracilis-ին անհրաժեշտ է մոտավորապես 30 օր՝ կերպարանափոխությունն ավարտելու համար56, կարելի է եզրակացնել, որ ցիպերմետրինի ուսումնասիրված կոնցենտրացիաները կարող են նպաստել բնակչության նվազմանը` կանխելով վարակված անհատների վաղ հասուն կամ վերարտադրողական փուլ մտնելը:
Միկրոմիջուկների և էրիթրոցիտների այլ միջուկային անոմալիաների հաշվարկված ռիսկի գնահատման ժամանակ CHQ արժեքները տատանվում էին 14,92-ից մինչև 97,00, ինչը ցույց է տալիս, որ ցիպերմետրինը պոտենցիալ գենոտոքսիկ վտանգ է ունեցել P. gracilis-ի համար նույնիսկ իր բնական միջավայրում: Հաշվի առնելով մահացությունը՝ քսենոբիոտիկ միացությունների առավելագույն կոնցենտրացիան, որը տանելի է P. gracilis-ի համար, կազմել է 4,24 μg L−1: Այնուամենայնիվ, 1 մկգ/լ ցածր կոնցենտրացիաները նույնպես ցույց են տվել գենոտոքսիկ ազդեցություն: Այս փաստը կարող է հանգեցնել աննորմալ առանձնյակների թվի ավելացմանը57 և ազդել տեսակների զարգացման և վերարտադրության վրա նրանց բնակավայրերում՝ հանգեցնելով երկկենցաղների պոպուլյացիայի նվազմանը:
Միջատասպան ցիպերմետրինի կոմերցիոն ձևակերպումները ցույց են տվել բարձր սուր և քրոնիկ թունավորություն P. gracilis-ի նկատմամբ: Դիտարկվել են մահացության ավելի բարձր ցուցանիշներ, հավանաբար թունավոր ազդեցությունների պատճառով, ինչի մասին վկայում են միկրոմիջուկների և էրիթրոցիտների միջուկային անոմալիաները, հատկապես ատամնավոր միջուկները, բլթակավոր միջուկները և վեզիկուլյար միջուկները: Բացի այդ, ուսումնասիրված տեսակները ցույց են տվել բնապահպանական ռիսկերի ավելացում՝ ինչպես սուր, այնպես էլ քրոնիկական: Այս տվյալները, համակցված մեր հետազոտական ​​խմբի նախորդ ուսումնասիրությունների հետ, ցույց են տվել, որ ցիպերմետրինի նույնիսկ տարբեր կոմերցիոն ձևակերպումները դեռևս առաջացնում են ացետիլխոլինէսթերազի (AChE) և բուտիրիլխոլինէսթերազի (BChE) ակտիվության նվազում և օքսիդատիվ սթրես58, և հանգեցրել են լողի ակտիվության փոփոխության և բերանի խոռոչի անսարքությունների59 P. gracilis-ում, որոնք ունեն բարձր կոմերցիոն ձևավորում և այլն: թունավորություն այս տեսակի համար. Հարթմանը և այլք: 60-ը պարզել է, որ ցիպերմետրինի կոմերցիոն ձևակերպումները P. gracilis-ի և նույն սեռի մեկ այլ տեսակի (P. cuvieri) համար ամենաթունավորն են՝ համեմատած ինը այլ թունաքիմիկատների հետ: Սա ենթադրում է, որ շրջակա միջավայրի պաշտպանության համար ցիպերմետրինի օրենսդրորեն հաստատված կոնցենտրացիաները կարող են հանգեցնել բարձր մահացության և բնակչության երկարաժամկետ նվազմանը:
Լրացուցիչ ուսումնասիրություններ են անհրաժեշտ՝ գնահատելու թունաքիմիկատի թունավորությունը երկկենցաղների համար, քանի որ շրջակա միջավայրում հայտնաբերված կոնցենտրացիաները կարող են առաջացնել բարձր մահացություն և պոտենցիալ վտանգ ներկայացնել P. gracilis-ի համար: Երկկենցաղների տեսակների վերաբերյալ հետազոտությունները պետք է խրախուսվեն, քանի որ այդ օրգանիզմների վերաբերյալ տվյալները սակավ են, հատկապես բրազիլական տեսակների վերաբերյալ:
Քրոնիկ թունավորության թեստը տևել է 168 ժամ (7 օր) ստատիկ պայմաններում և ենթամահացու կոնցենտրացիաները եղել են՝ 1, 3, 6 և 20 μg ai L−1: Երկու փորձարկումներում յուրաքանչյուր բուժման խմբում 10 շերեփուկ է գնահատվել վեց կրկնությամբ, ընդհանուր առմամբ 60 շերեփուկ մեկ կոնցենտրացիայի համար: Մինչդեռ միայն ջրային բուժումը ծառայեց որպես բացասական հսկողություն։ Յուրաքանչյուր փորձնական սարքավորում բաղկացած էր 500 մլ տարողությամբ ստերիլ ապակյա ամանից և 50 մլ լուծույթի համար 1 շերեփուկի խտությամբ: Գոլորշիացումը կանխելու համար կոլբը ծածկված էր պոլիէթիլենային թաղանթով և անընդհատ օդափոխվում էր:
Ջուրը քիմիապես վերլուծվել է թունաքիմիկատների կոնցենտրացիաները որոշելու համար 0, 96 և 168 ժամվա ընթացքում: Ըստ Sabin et al. 68 և Martins et al. 69, անալիզներն իրականացվել են Սանտա Մարիայի Դաշնային համալսարանի թունաքիմիկատների վերլուծության լաբորատորիայում (LARP)՝ օգտագործելով գազային քրոմատոգրաֆիա՝ զուգակցված եռակի քառաբևեռ զանգվածային սպեկտրոմետրիայի հետ (Varian model 1200, Պալո Ալտո, Կալիֆորնիա, ԱՄՆ): Ջրում թունաքիմիկատների քանակական որոշումը ներկայացված է որպես լրացուցիչ նյութ (Աղյուսակ SM1):
Միկրոմիջուկային թեստի (MNT) և կարմիր բջիջների միջուկային աննորմալության թեստի (ՌՆԹ) համար վերլուծվել են 15 շերեփուկներ յուրաքանչյուր բուժման խմբից: Շերեփուկները անզգայացվել են 5% լիդոկաինով (50 մգ գ-170) և արյան նմուշներ են հավաքվել սրտի պունկցիայի միջոցով՝ օգտագործելով միանգամյա օգտագործման հեպարինացված ներարկիչներ: Մանրադիտակի ստերիլ սլայդների վրա պատրաստել են արյան քսուք, չորացրել են օդով, ամրացրել 100% մեթանոլով (4 °C) 2 րոպե, այնուհետև ներկել 10% Giemsa լուծույթով 15 րոպե մթության մեջ: Գործընթացի վերջում սլայդները լվացվեցին թորած ջրով, որպեսզի հեռացնեն ավելորդ բիծը և չորացրին սենյակային ջերմաստիճանում:
Յուրաքանչյուր շերեփուկից առնվազն 1000 րիտրոցներ վերլուծվել են 100× մանրադիտակի միջոցով՝ 71 նպատակակետով՝ որոշելու MN-ի և ENA-ի առկայությունը: Ընդհանուր առմամբ 75,796 րիտրոցներ շերեփուկներից գնահատվել են՝ հաշվի առնելով ցիպերմետրինի կոնցենտրացիաները և վերահսկումը: Գենոտոքսիկությունը վերլուծվել է ըստ Carrasco et al-ի մեթոդի: և Fenech et al.38,72՝ որոշելով հետևյալ միջուկային վնասվածքների հաճախականությունը. (1) միջուկային բջիջներ. (2) ապոպտոտիկ բջիջներ. միջուկային մասնատում, ծրագրավորված բջիջների մահ; (3) երկմիջուկային բջիջներ. երկու միջուկներով բջիջներ. 4) միջուկային բողբոջներ կամ բշտիկներ. 5) կարիոլիզացված բջիջներ. բջիջներ միայն միջուկի ուրվագիծով, առանց ներքին նյութի. 6) խզված բջիջներ. բջիջներ՝ ակնհայտ ճաքերով կամ իրենց ձևի կտրվածքներով, որոնք նաև կոչվում են երիկամաձև միջուկներ. 7) լոբուլացված բջիջներ. և (8) միկրոբջիջներ՝ խտացված միջուկներով և կրճատված ցիտոպլազմով բջիջներ: Փոփոխությունները համեմատվել են վերահսկողության բացասական արդյունքների հետ։
Սուր թունավորության թեստի արդյունքները (LC50) վերլուծվել են GBasic ծրագրաշարի և TSK-Trimmed Spearman-Karber մեթոդի միջոցով74: Քրոնիկական թեստի տվյալները նախապես փորձարկվել են սխալի նորմալության (Շապիրո-Վիլքս) և շեղումների միատարրության համար (Բարտլետ): Արդյունքները վերլուծվել են միակողմանի շեղումների վերլուծության (ANOVA) միջոցով: Tukey-ի թեստը օգտագործվել է միմյանց միջև տվյալների համեմատության համար, իսկ Dunnett-ի թեստը օգտագործվել է բուժման խմբի և բացասական վերահսկման խմբի տվյալների համեմատության համար:
LOEC և NOEC տվյալները վերլուծվել են Dunnett թեստի միջոցով: Վիճակագրական թեստերը կատարվել են Statistica 8.0 ծրագրաշարի (StatSoft) 95% նշանակության մակարդակով (p <0.05):