Գենոմի լայնածավալ նույնականացում և մանանեխի աճի կարգավորման գործոնների արտահայտման վերլուծություն երաշտի պայմաններում

Գուիչժոու նահանգում տեղումների սեզոնային բաշխումը անհավասար է՝ գարնանը և ամռանը տեղումները ավելի շատ են, սակայն կանոլայի սածիլները աշնանը և ձմռանը ենթակա են երաշտի սթրեսի, ինչը լրջորեն ազդում է բերքատվության վրա: Մանանեխը հատուկ յուղատու մշակաբույս ​​է, որը հիմնականում աճեցվում է Գուիչժոու նահանգում: Այն ունի երաշտի նկատմամբ ուժեղ դիմադրողականություն և կարող է աճեցվել լեռնային շրջաններում: Այն երաշտի նկատմամբ դիմադրողական գեների հարուստ ռեսուրս է: Երաշտի նկատմամբ դիմադրողական գեների հայտնաբերումը կարևոր նշանակություն ունի մանանեխի տեսակների բարելավման և սաղմնային ռեսուրսների նորարարության համար: GRF ընտանիքը կարևոր դեր է խաղում բույսերի աճի և զարգացման, ինչպես նաև երաշտի նկատմամբ արձագանքման գործում: Ներկայումս GRF գեները հայտնաբերվել են Arabidopsis 2-ում, բրնձում (Oryza sativa) 12-ում, կանոլայում 13-ում, բամբակում (Gossypium hirsutum) 14-ում, ցորենում (Triticum aestivum) 15-ում, մարգարիտ կորեկում (Setaria italica) 16-ում և Brassica 17-ում, սակայն մանանեխում GRF գեների հայտնաբերման մասին հաղորդագրություններ չկան: Այս ուսումնասիրության մեջ մանանեխի GRF ընտանիքի գեները նույնականացվել են գենոմի լայն մակարդակով և վերլուծվել են դրանց ֆիզիկական և քիմիական բնութագրերը, էվոլյուցիոն կապերը, հոմոլոգիան, պահպանված մոտիվները, գեների կառուցվածքը, գեների կրկնօրինակումները, ցիս-տարրերը և սածիլային փուլը (չորս տերևանոց փուլ): Երաշտի սթրեսի պայմաններում արտահայտման օրինաչափությունները համապարփակ վերլուծվել են՝ երաշտի նկատմամբ BjGRF գեների պոտենցիալ գործառույթի վերաբերյալ հետագա ուսումնասիրությունների գիտական ​​հիմք ապահովելու և երաշտին դիմացկուն մանանեխի բուծման համար թեկնածու գեներ տրամադրելու համար:
Երկու HMMER որոնումների միջոցով Brassica juncea գենոմում նույնականացվել է երեսունչորս BjGRF գեն, որոնցից բոլորն էլ պարունակում են QLQ և WRC տիրույթները: Նույնականացված BjGRF գեների CDS հաջորդականությունները ներկայացված են լրացուցիչ աղյուսակ S1-ում: BjGRF01–BjGRF34-ը անվանակոչվել են քրոմոսոմի վրա դրանց գտնվելու վայրի հիման վրա: Այս ընտանիքի ֆիզիկաքիմիական հատկությունները ցույց են տալիս, որ ամինաթթվի երկարությունը խիստ փոփոխական է՝ տատանվելով 261 aa-ից (BjGRF19) մինչև 905 aa (BjGRF28): BjGRF-ի իզոէլեկտրական կետը տատանվում է 6.19-ից (BjGRF02) մինչև 9.35 (BjGRF03)՝ միջինը 8.33, և BjGRF-ի 88.24%-ը հիմնական սպիտակուց է: BjGRF-ի կանխատեսված մոլեկուլային քաշի միջակայքը 29.82 կԴա-ից (BjGRF19) մինչև 102.90 կԴա (BjGRF28) է: BjGRF սպիտակուցների անկայունության ինդեքսը տատանվում է 51.13-ից (BjGRF08) մինչև 78.24 (BjGRF19), բոլորն էլ մեծ են 40-ից, ինչը ցույց է տալիս, որ ճարպաթթվային ինդեքսը տատանվում է 43.65-ից (BjGRF01) մինչև 78.78 (BjGRF22), միջին հիդրոֆիլությունը (GRAVY) տատանվում է -1.07-ից (BjGRF31) մինչև -0.45 (BjGRF22), բոլոր հիդրոֆիլ BjGRF սպիտակուցներն ունեն բացասական GRAVY արժեքներ, ինչը կարող է պայմանավորված լինել մնացորդների կողմից առաջացած հիդրոֆոբության բացակայությամբ։ Ենթաբջջային տեղայնացման կանխատեսումը ցույց տվեց, որ 31 BjGRF կոդավորված սպիտակուցներ կարող են տեղայնացվել կորիզում, BjGRF04-ը՝ պերօքսիսոմներում, BjGRF25-ը՝ ցիտոպլազմայում, իսկ BjGRF28-ը՝ քլորոպլաստներում (աղյուսակ 1), ինչը ցույց է տալիս, որ BjGRF-ները կարող են տեղայնացվել կորիզում և խաղալ կարևոր կարգավորիչ դեր որպես տրանսկրիպցիոն գործոն։
Տարբեր տեսակների GRF ընտանիքների ֆիլոգենետիկ վերլուծությունը կարող է օգնել գեների ֆունկցիաների ուսումնասիրությանը: Հետևաբար, ներբեռնվել են 35 կանոլայի, 16 շաղգամի, 12 բրնձի, 10 կորեկի և 9 Arabidopsis GRF-ների լրիվ ամինաթթվային հաջորդականությունները, և կառուցվել է ֆիլոգենետիկ ծառ՝ հիմնվելով 34 նույնականացված BjGRF գեների վրա (Նկար 1): Երեք ենթաընտանիքները պարունակում են տարբեր թվով անդամներ. 116 GRF TF-ները բաժանված են երեք տարբեր ենթաընտանիքների (A~C խմբեր), որոնք պարունակում են GRF-ների համապատասխանաբար 59 (50.86%), 34 (29.31%) և 23 (19.83)%-ը: Դրանցից 34 BjGRF ընտանիքի անդամները ցրված են 3 ենթաընտանիքներում՝ 13 անդամ A խմբում (38.24%), 12 անդամ B խմբում (35.29%) և 9 անդամ C խմբում (26.47%): Մանանեխի պոլիպլոիդացման գործընթացում տարբեր ենթաընտանիքներում BjGRFs գեների քանակը տարբեր է, և հնարավոր է, որ տեղի է ունեցել գեների ուժեղացում և կորուստ: Հարկ է նշել, որ C խմբում բրնձի և կորեկի GRF-ների բաշխում չկա, մինչդեռ B խմբում կա 2 բրնձի GRF և 1 կորեկի GRF, և բրնձի և կորեկի GRF-ների մեծ մասը խմբավորված է մեկ ճյուղում, ինչը ցույց է տալիս, որ BjGRF-ները սերտորեն կապված են երկկոտ բույսերի հետ: Դրանց մեջ Arabidopsis thaliana-ի GRF ֆունկցիայի վերաբերյալ ամենախորին ուսումնասիրությունները հիմք են հանդիսանում BjGRF-ների ֆունկցիոնալ ուսումնասիրությունների համար:
Մանանեխի ֆիլոգենետիկ ծառը, որը ներառում է Brassica napus-ը, Brassica napus-ը, բրինձը, կորեկը և Arabidopsis thaliana GRF ընտանիքի անդամները։
Մանանեխի GRF ընտանիքի կրկնվող գեների վերլուծություն: Ետին պլանում մոխրագույն գիծը ներկայացնում է մանանեխի գենոմի համաժամանակյա բլոկը, կարմիր գիծը՝ BjGRF գենի հատվածավորված կրկնությունների զույգը։
BjGRF գենի արտահայտությունը չորային սթրեսի պայմաններում չորրորդ տերևի փուլում: qRT-PCR տվյալները ներկայացված են լրացուցիչ աղյուսակ S5-ում: Տվյալների զգալի տարբերությունները նշված են փոքրատառերով:
Քանի որ համաշխարհային կլիման շարունակում է փոխվել, ուսումնասիրությունը, թե ինչպես են մշակաբույսերը հաղթահարում երաշտի սթրեսը և բարելավում դրանց դիմադրողականության մեխանիզմները, դարձել է թեժ հետազոտական ​​թեմա18: Երաշտից հետո բույսերի ձևաբանական կառուցվածքը, գեների արտահայտությունը և նյութափոխանակության գործընթացները կփոխվեն, ինչը կարող է հանգեցնել ֆոտոսինթեզի դադարեցմանը և նյութափոխանակության խանգարմանը, ազդելով մշակաբույսերի բերքատվության և որակի վրա19,20,21: Երբ բույսերը զգում են երաշտի ազդանշանները, նրանք արտադրում են երկրորդային մեսենջերներ, ինչպիսիք են Ca2+-ը և ֆոսֆատիդիլինոզիտոլը, մեծացնում են կալցիումի իոնների ներբջջային կոնցենտրացիան և ակտիվացնում սպիտակուցի ֆոսֆորիլացման ուղու կարգավորիչ ցանցը22,23: Վերջնական թիրախային սպիտակուցը անմիջականորեն ներգրավված է բջջային պաշտպանության մեջ կամ կարգավորում է սթրեսի հետ կապված գեների արտահայտությունը TF-ների միջոցով՝ բարձրացնելով բույսերի դիմադրողականությունը սթրեսի նկատմամբ24,25: Այսպիսով, TF-ները կարևոր դեր են խաղում երաշտի սթրեսին արձագանքելու գործում: Երաշտի սթրեսին արձագանքող TF-ների հաջորդականության և ԴՆԹ-ի կապող հատկությունների համաձայն, TF-ները կարելի է բաժանել տարբեր ընտանիքների, ինչպիսիք են GRF, ERF, MYB, WRKY և այլ ընտանիքներ26:
GRF գեների ընտանիքը բույսերի համար բնորոշ TF-ի տեսակ է, որը կարևոր դեր է խաղում տարբեր ասպեկտներում, ինչպիսիք են աճը, զարգացումը, ազդանշանի փոխանցումը և բույսերի պաշտպանական արձագանքները27: O. sativa-ում առաջին GRF գենի հայտնաբերումից ի վեր28, շատ տեսակների մոտ ավելի ու ավելի շատ GRF գեներ են հայտնաբերվել, և ցույց է տրվել, որ դրանք ազդում են բույսերի աճի, զարգացման և սթրեսի արձագանքի վրա8, 29, 30,31,32: Brassica juncea գենոմի հաջորդականության հրապարակմամբ հնարավոր դարձավ BjGRF գեների ընտանիքի նույնականացումը33: Այս ուսումնասիրության մեջ մանանեխի ամբողջ գենոմում նույնականացվել են 34 BjGRF գեներ և անվանվել են BjGRF01–BjGRF34՝ հիմնվելով դրանց քրոմոսոմային դիրքի վրա: Դրանցից բոլորը պարունակում են բարձր պահպանված QLQ և WRC տիրույթներ: Ֆիզիկաքիմիական հատկությունների վերլուծությունը ցույց տվեց, որ BjGRF սպիտակուցների (բացառությամբ BjGRF28-ի) ամինաթթուների քանակի և մոլեկուլային քաշի տարբերությունները նշանակալի չեն, ինչը ցույց է տալիս, որ BjGRF ընտանիքի անդամները կարող են ունենալ նմանատիպ գործառույթներ: Գեների կառուցվածքի վերլուծությունը ցույց տվեց, որ BjGRF գեների 64.7%-ը պարունակում է 4 էկզոն, ինչը ցույց է տալիս, որ BjGRF գենի կառուցվածքը համեմատաբար պահպանվել է էվոլյուցիայի ընթացքում, սակայն BjGRF10, BjGRF16, BjGRP28 և BjGRF29 գեներում էկզոնների թիվն ավելի մեծ է: Ուսումնասիրությունները ցույց են տվել, որ էկզոնների կամ ինտրոնների ավելացումը կամ ջնջումը կարող է հանգեցնել գեների կառուցվածքի և ֆունկցիայի տարբերությունների, այդպիսով ստեղծելով նոր գեներ34,35,36: Հետևաբար, մենք ենթադրում ենք, որ BjGRF-ի ինտրոնը կորել է էվոլյուցիայի ընթացքում, ինչը կարող է գեների ֆունկցիայի փոփոխությունների պատճառ դառնալ: Համապատասխանելով առկա ուսումնասիրություններին, մենք նաև պարզեցինք, որ ինտրոնների թիվը կապված է գեների արտահայտման հետ: Երբ գենում ինտրոնների թիվը մեծ է, գենը կարող է արագ արձագանքել տարբեր անբարենպաստ գործոնների:
Գեների կրկնօրինակումը գենոմային և գենետիկական էվոլյուցիայի հիմնական գործոն է37: Առնչվող ուսումնասիրությունները ցույց են տվել, որ գեների կրկնօրինակումը ոչ միայն մեծացնում է GRF գեների քանակը, այլև ծառայում է որպես նոր գեների ստեղծման միջոց՝ բույսերին օգնելու հարմարվել տարբեր անբարենպաստ շրջակա միջավայրի պայմաններին38: Այս ուսումնասիրության ընթացքում հայտնաբերվել է ընդհանուր առմամբ 48 կրկնօրինակ գեների զույգ, որոնցից բոլորն էլ հատվածային կրկնօրինակումներ էին, ինչը ցույց է տալիս, որ հատվածային կրկնօրինակումները այս ընտանիքում գեների քանակը մեծացնելու հիմնական մեխանիզմն են: Գրականության մեջ նշվում է, որ հատվածային կրկնօրինակումը կարող է արդյունավետորեն խթանել GRF գեների ընտանիքի անդամների ուժեղացումը Arabidopsis-ում և ելակում, և այս գեների ընտանիքի տանդեմային կրկնօրինակում չի հայտնաբերվել տեսակներից ոչ մեկում27,39: Այս ուսումնասիրության արդյունքները համապատասխանում են Arabidopsis thaliana-ի և ելակ ընտանիքների վերաբերյալ առկա ուսումնասիրություններին, ինչը ենթադրում է, որ GRF ընտանիքը կարող է մեծացնել գեների քանակը և առաջացնել նոր գեներ՝ տարբեր բույսերում հատվածային կրկնօրինակման միջոցով:
Այս ուսումնասիրության մեջ մանանեխում հայտնաբերվել է ընդհանուր առմամբ 34 BjGRF գեն, որոնք բաժանվել են 3 ենթաընտանիքների: Այս գեները ցույց են տվել նմանատիպ պահպանված մոտիվներ և գեների կառուցվածքներ: Կոլլինարության վերլուծությունը բացահայտել է մանանեխում հատվածների կրկնօրինակման 48 զույգ: BjGRF պրոմոտորային շրջանը պարունակում է ցիս-գործող տարրեր, որոնք կապված են լույսի արձագանքի, հորմոնալ արձագանքի, շրջակա միջավայրի սթրեսի արձագանքի, ինչպես նաև աճի և զարգացման հետ: 34 BjGRF գեների արտահայտությունը հայտնաբերվել է մանանեխի սածիլի փուլում (արմատներ, ցողուններ, տերևներ), և 10 BjGRF գեների արտահայտման օրինաչափությունը երաշտի պայմաններում: Պարզվել է, որ BjGRF գեների արտահայտման օրինաչափությունները երաշտի սթրեսի պայմաններում նման էին և կարող են նման լինել: BjGRF03 և BjGRF32 գեները կարող են դրական կարգավորիչ դեր ունենալ երաշտի սթրեսի դեպքում, մինչդեռ BjGRF06 և BjGRF23 գեները դեր են խաղում երաշտի սթրեսի դեպքում որպես miR396 թիրախային գեներ: Ընդհանուր առմամբ, մեր ուսումնասիրությունը կենսաբանական հիմք է ապահովում Brassicaceae բույսերում BjGRF գեների ֆունկցիայի ապագա հայտնաբերման համար:
Այս փորձի մեջ օգտագործված մանանեխի սերմերը տրամադրվել են Գույչժոուի յուղային սերմերի հետազոտական ​​ինստիտուտի, Գույչժոուի գյուղատնտեսական գիտությունների ակադեմիայի կողմից: Ընտրեք ամբողջական սերմերը և տնկեք դրանք հողի մեջ (ենթաշերտ՝ հող = 3:1), իսկ արմատները, ցողունները և տերևները հավաքեք չորս տերևանոց փուլից հետո: Բույսերը մշակվել են 20% PEG 6000-ով՝ երաշտը մոդելավորելու համար, և տերևները հավաքվել են 0, 3, 6, 12 և 24 ժամ հետո: Բոլոր բույսերի նմուշները անմիջապես սառեցվել են հեղուկ ազոտի մեջ, ապա պահվել -80°C սառնարանում՝ հաջորդ փորձարկման համար:
Այս ուսումնասիրության ընթացքում ստացված կամ վերլուծված բոլոր տվյալները ներառված են հրապարակված հոդվածում և լրացուցիչ տեղեկատվական ֆայլերում։