Երաշտի պայմաններում մանանեխի աճի կարգավորման գործոնների գենոմի նույնականացում և արտահայտման վերլուծություն

Տեղումների սեզոնային բաշխումը Գույչժոու նահանգում անհավասար է, ավելի շատ տեղումներ են լինում գարնանը և ամռանը, սակայն ռապսի սածիլները ենթակա են երաշտի սթրեսի աշնանը և ձմռանը, ինչը լրջորեն ազդում է բերքատվության վրա: Մանանեխը հատուկ յուղոտ մշակաբույս ​​է, որը հիմնականում աճեցվում է Գույչժոու նահանգում: Այն ունի ուժեղ երաշտի դիմացկուն և կարող է աճել լեռնային շրջաններում: Այն երաշտի դիմացկուն գեների հարուստ պաշար է։ Երաշտին դիմացկուն գեների հայտնաբերումը կարևոր նշանակություն ունի մանանեխի սորտերի բարելավման համար: և նորարարություն գերմպլազմայի ռեսուրսներում: GRF ընտանիքը կարևոր դեր է խաղում բույսերի աճի և զարգացման և երաշտի սթրեսին արձագանքելու գործում: Ներկայումս GRF գեներ են հայտնաբերվել Arabidopsis 2, բրնձի (Oryza sativa) 12, ռապանի սերմերի 13, բամբակի (Gossypium hirsutum) 14, ցորենի (Triticum) մեջ: aestivum)15, մարգարիտ կորեկ (Setaria italica)16 և Brassica17, սակայն մանանեխի մեջ հայտնաբերված GRF գեների մասին հաղորդումներ չկան: Այս ուսումնասիրության ընթացքում մանանեխի GRF ընտանիքի գեները բացահայտվել են գենոմի ամբողջ մակարդակում և վերլուծվել դրանց ֆիզիկական և քիմիական բնութագրերը, էվոլյուցիոն հարաբերությունները, հոմոոլոգիան, պահպանված մոտիվները, գենի կառուցվածքը, գեների կրկնօրինակումները, cis-տարրերը և սածիլների փուլը (չորս տերևի փուլ): Երաշտի սթրեսի տակ արտահայտված ձևերը համակողմանիորեն վերլուծվել են՝ գիտական ​​հիմքեր ապահովելու համար BjGRF գեների երաշտին արձագանքման պոտենցիալ ֆունկցիայի վերաբերյալ հետագա ուսումնասիրությունների և երաշտին հանդուրժող մանանեխի բուծման թեկնածու գեներ ապահովելու համար:
Brassica juncea գենոմում հայտնաբերվել են երեսունչորս BjGRF գեներ՝ օգտագործելով երկու HMMER որոնումներ, որոնք բոլորն էլ պարունակում են QLQ և WRC տիրույթներ: Նույնացված BjGRF գեների CDS հաջորդականությունները ներկայացված են Լրացուցիչ Աղյուսակ S1-ում: BjGRF01–BjGRF34-ն անվանվում են՝ ելնելով քրոմոսոմի վրա իրենց գտնվելու վայրից: Այս ընտանիքի ֆիզիկաքիմիական հատկությունները ցույց են տալիս, որ ամինաթթվի երկարությունը խիստ փոփոխական է՝ տատանվում է 261 աա (BjGRF19) մինչև 905 աա (BjGRF28): BjGRF-ի իզոէլեկտրական կետը տատանվում է 6,19-ից (BjGRF02)-ից մինչև 9,35 (BjGRF03)՝ միջինը 8,33, իսկ BjGRF-ի 88,24%-ը հիմնական սպիտակուց է: BjGRF-ի կանխատեսված մոլեկուլային քաշի միջակայքը կազմում է 29,82 կԴա (BjGRF19) մինչև 102,90 կԴա (BjGRF28); BjGRF սպիտակուցների անկայունության ինդեքսը տատանվում է 51,13-ից (BjGRF08)-ից մինչև 78,24 (BjGRF19), բոլորը 40-ից մեծ են, ինչը ցույց է տալիս, որ ճարպաթթուների ինդեքսը տատանվում է 43,65-ից (BjGRF01)-ից մինչև 78,78 (BjGRFY1-ի միջակայքը միջին հիդրո-1-22): (BjGRF31) մինչև -0.45 (BjGRF22), բոլոր հիդրոֆիլ BjGRF սպիտակուցներն ունեն բացասական GRAVY արժեքներ, ինչը կարող է պայմանավորված լինել մնացորդների հետևանքով առաջացած հիդրոֆոբության բացակայությամբ: Ենթաբջջային տեղայնացման կանխատեսումը ցույց է տվել, որ 31 BjGRF կոդավորված սպիտակուցներ կարող են տեղայնացվել միջուկում, BjGRF04-ը կարող է տեղայնացվել պերօքսիսոմներում, BjGRF25-ը կարող է տեղայնացվել ցիտոպլազմայում, իսկ BjGRF28-ը կարող է տեղայնացվել քլորոպլաստներում (Աղյուսակ 1), ինչը ցույց է տալիս, որ BjGRF-ը կարող է տեղայնացված լինել: դերը որպես տառադարձման գործոն:
Տարբեր տեսակների GRF ընտանիքների ֆիլոգենետիկ վերլուծությունը կարող է օգնել ուսումնասիրել գեների գործառույթները: Հետևաբար, 35 ռափսե սերմի, 16 շաղգամի, 12 բրնձի, 10 կորեկի և 9 Arabidopsis GRF-ների ամբողջական երկարությամբ ամինաթթուների հաջորդականությունները ներբեռնվեցին, և 34 բացահայտված BjGRF գեների հիման վրա կառուցվեց ֆիլոգենետիկ ծառ (նկ. 1): Երեք ենթաընտանիքները պարունակում են տարբեր թվով անդամներ. 116 GRF TF-ները բաժանված են երեք տարբեր ենթաընտանիքների (A~C խմբեր), որոնք պարունակում են համապատասխանաբար 59 (50.86%), 34 (29.31%) և 23 (19.83)% GRF-ներ: Նրանցից 34 BjGRF ընտանիքի անդամները ցրված են 3 ենթաընտանիքում՝ 13 անդամ A խմբում (38,24%), 12 անդամ՝ B խմբում (35,29%) և 9 անդամ C խմբում (26,47%): Մանանեխի պոլիպլոիդացման գործընթացում BjGRFs գեների թիվը տարբեր ենթաընտանիքներում տարբեր է, և կարող է տեղի ունենալ գեների ուժեղացում և կորուստ: Հարկ է նշել, որ C խմբում բրնձի և կորեկի GRF-ների բաշխում չկա, մինչդեռ B խմբում կա 2 բրնձի GRF և 1 կորեկի GRF, և բրնձի և կորեկի GRF-ների մեծ մասը խմբավորված է մեկ ճյուղում, ինչը ցույց է տալիս, որ BjGRF-ները սերտորեն կապված են դիկոտիկների հետ: Դրանց թվում Արաբիդոպսիս թալիանայում GRF ֆունկցիայի վերաբերյալ առավել խորը ուսումնասիրությունները հիմք են տալիս BjGRF-ների ֆունկցիոնալ ուսումնասիրությունների համար:
Մանանեխի ֆիլոգենետիկ ծառ, ներառյալ Brassica napus, Brassica napus, բրինձ, կորեկ և Arabidopsis thaliana GRF ընտանիքի անդամներ:
Մանանեխի GRF ընտանիքում կրկնվող գեների վերլուծություն: Ֆոնի վրա մոխրագույն գիծը ներկայացնում է մանանեխի գենոմի համաժամանակյա բլոկը, կարմիր գիծը ներկայացնում է BjGRF գենի մի զույգ հատվածավոր կրկնություններ;
BjGRF գենի արտահայտությունը չորրորդ տերևային փուլում երաշտի պայմաններում: qRT-PCR տվյալները ներկայացված են Լրացուցիչ Աղյուսակ S5-ում: Տվյալների զգալի տարբերությունները նշվում են փոքրատառերով:
Քանի որ գլոբալ կլիման շարունակում է փոխվել, ուսումնասիրությունը, թե ինչպես են մշակաբույսերը հաղթահարում երաշտի սթրեսը և բարելավելով իրենց հանդուրժողականության մեխանիզմները, դարձել է թեժ հետազոտության թեմա18: Երաշից հետո բույսերի մորֆոլոգիական կառուցվածքը, գեների էքսպրեսիան և նյութափոխանակության գործընթացները կփոխվեն, ինչը կարող է հանգեցնել ֆոտոսինթեզի դադարեցման և նյութափոխանակության խանգարման՝ ազդելով մշակաբույսերի բերքատվության և որակի վրա19,20,21: Երբ բույսերը զգում են երաշտի ազդանշանները, նրանք արտադրում են երկրորդ սուրհանդակներ, ինչպիսիք են Ca2+ և ֆոսֆատիդիլինոզիտոլը, մեծացնում են կալցիումի իոնի ներբջջային կոնցենտրացիան և ակտիվացնում սպիտակուցի ֆոսֆորիլացման ուղու կարգավորիչ ցանցը22,23: Վերջնական թիրախային սպիտակուցը անմիջականորեն մասնակցում է բջջային պաշտպանությանը կամ կարգավորում է սթրեսային գեների արտահայտումը TF-ների միջոցով՝ ուժեղացնելով բույսերի հանդուրժողականությունը սթրեսի նկատմամբ24,25: Այսպիսով, TF-ները վճռորոշ դեր են խաղում երաշտի սթրեսին արձագանքելու գործում: Ըստ երաշտի սթրեսին արձագանքող TF-ների հաջորդականության և ԴՆԹ-ի կապակցման հատկությունների, TF-ները կարելի է բաժանել տարբեր ընտանիքների, ինչպիսիք են GRF, ERF, MYB, WRKY և այլ ընտանիքներ26:
GRF գեների ընտանիքը բույսերին հատուկ TF-ի մի տեսակ է, որը կարևոր դեր է խաղում տարբեր ասպեկտներում, ինչպիսիք են աճը, զարգացումը, ազդանշանի փոխակերպումը և բույսերի պաշտպանության պատասխանները27: Քանի որ առաջին GRF գենը հայտնաբերվել է O. sativa28-ում, ավելի ու ավելի շատ GRF գեներ են հայտնաբերվել շատ տեսակների մեջ և ցույց են տվել, որ դրանք ազդում են բույսերի աճի, զարգացման և սթրեսի արձագանքման վրա8, 29, 30,31,32: Brassica juncea գենոմի հաջորդականության հրապարակմամբ հնարավոր դարձավ BjGRF գենային ընտանիքի նույնականացումը33: Այս ուսումնասիրության ընթացքում 34 BjGRF գեն է հայտնաբերվել մանանեխի ամբողջ գենոմում և անվանվել BjGRF01–BjGRF34՝ ելնելով նրանց քրոմոսոմային դիրքից: Դրանք բոլորը պարունակում են խիստ պահպանված QLQ և WRC տիրույթներ։ Ֆիզիկական քիմիական հատկությունների վերլուծությունը ցույց է տվել, որ BjGRF սպիտակուցների ամինաթթուների թվերի և մոլեկուլային կշիռների տարբերությունները (բացառությամբ BjGRF28-ի) նշանակալի չեն, ինչը ցույց է տալիս, որ BjGRF ընտանիքի անդամները կարող են ունենալ նմանատիպ գործառույթներ: Գենի կառուցվածքի վերլուծությունը ցույց է տվել, որ BjGRF գեների 64.7%-ը պարունակում է 4 էկզոն, ինչը ցույց է տալիս, որ BjGRF գենի կառուցվածքը համեմատաբար պահպանված է էվոլյուցիայի ընթացքում, սակայն BjGRF10, BjGRF16, BjGRP28 և BjGRF29 գեներում էկզոնների թիվն ավելի մեծ է: Ուսումնասիրությունները ցույց են տվել, որ էկզոնների կամ ինտրոնների ավելացումը կամ ջնջումը կարող է հանգեցնել գեների կառուցվածքի և ֆունկցիայի տարբերությունների՝ դրանով իսկ ստեղծելով նոր գեներ34,35,36: Հետևաբար, մենք ենթադրում ենք, որ BjGRF-ի ինտրոնը կորել է էվոլյուցիայի ընթացքում, ինչը կարող է առաջացնել գեների ֆունկցիայի փոփոխություններ: Գոյություն ունեցող ուսումնասիրություններին համապատասխան՝ մենք նաև պարզեցինք, որ ինտրոնների քանակը կապված է գեների արտահայտման հետ: Երբ գենում ինտրոնների թիվը մեծ է, գենը կարող է արագ արձագանքել տարբեր անբարենպաստ գործոնների:
Գեների կրկնօրինակումը գենոմային և գենետիկական էվոլյուցիայի հիմնական գործոն է37: Առնչվող ուսումնասիրությունները ցույց են տվել, որ գեների կրկնօրինակումը ոչ միայն մեծացնում է GRF գեների քանակը, այլև ծառայում է որպես նոր գեների ստեղծման միջոց՝ բույսերին օգնելու հարմարվել տարբեր անբարենպաստ շրջակա միջավայրի պայմաններին38: Այս ուսումնասիրության ընթացքում հայտնաբերվել է ընդհանուր առմամբ 48 կրկնօրինակ գեների զույգ, որոնցից բոլորն էլ հատվածային կրկնօրինակումներ էին, ինչը ցույց է տալիս, որ հատվածային կրկնօրինակումները այս ընտանիքում գեների քանակը մեծացնելու հիմնական մեխանիզմն են: Գրականության մեջ նշվում է, որ հատվածային կրկնօրինակումը կարող է արդյունավետորեն խթանել GRF գեների ընտանիքի անդամների ուժեղացումը Arabidopsis-ում և ելակում, և այս գեների ընտանիքի տանդեմային կրկնօրինակում չի հայտնաբերվել տեսակներից ոչ մեկում27,39: Այս ուսումնասիրության արդյունքները համապատասխանում են Arabidopsis thaliana-ի և ելակ ընտանիքների վերաբերյալ առկա ուսումնասիրություններին, ինչը ենթադրում է, որ GRF ընտանիքը կարող է մեծացնել գեների քանակը և առաջացնել նոր գեներ՝ տարբեր բույսերում հատվածային կրկնօրինակման միջոցով:
Այս հետազոտության ընթացքում մանանեխի մեջ հայտնաբերվել են ընդհանուր առմամբ 34 BjGRF գեն, որոնք բաժանվել են 3 ենթաընտանիքի: Այս գեները ցույց են տվել նմանատիպ պահպանված մոտիվներ և գենային կառուցվածքներ: Կոլինայնության վերլուծությունը մանանեխի մեջ հայտնաբերել է 48 զույգ հատվածների կրկնօրինակումներ: BjGRF խթանող շրջանը պարունակում է cis գործող տարրեր, որոնք կապված են լույսի արձագանքման, հորմոնալ արձագանքի, շրջակա միջավայրի սթրեսի արձագանքման և աճի և զարգացման հետ: 34 BjGRF գեների էքսպրեսիան հայտնաբերվել է մանանեխի սածիլների փուլում (արմատներ, ցողուններ, տերևներ), իսկ երաշտի պայմաններում 10 BjGRF գեների արտահայտման ձև: Պարզվել է, որ երաշտի սթրեսի պայմաններում BjGRF գեների արտահայտման ձևերը նման են և կարող են նման լինել: ներգրավվածությունը երաշտի Ստիպողական կարգավորում. BjGRF03 և BjGRF32 գեները կարող են դրական կարգավորիչ դեր խաղալ երաշտի սթրեսում, մինչդեռ BjGRF06 և BjGRF23 դերեր են խաղում երաշտի սթրեսում՝ որպես miR396 թիրախային գեներ: Ընդհանուր առմամբ, մեր ուսումնասիրությունը կենսաբանական հիմք է ապահովում BjGRF գենի ֆունկցիայի ապագա հայտնաբերման համար Brassicaceae բույսերում:
Այս փորձի ժամանակ օգտագործված մանանեխի սերմերը տրամադրվել են Գույչժոուի յուղի սերմերի հետազոտական ​​ինստիտուտի կողմից, Գույչժոուի գյուղատնտեսական գիտությունների ակադեմիան: Ընտրեք ամբողջ սերմերը և տնկեք հողի մեջ (սուբստրատ՝ հող = 3։1), իսկ քառատև փուլից հետո հավաքեք արմատները, ցողունները և տերևները։ Բույսերը մշակվել են 20% PEG 6000 երաշտի նմանակման համար, իսկ տերևները հավաքվել են 0, 3, 6, 12 և 24 ժամ հետո: Բույսերի բոլոր նմուշները անմիջապես սառեցվեցին հեղուկ ազոտի մեջ, այնուհետև պահվեցին -80°C սառցախցիկում հաջորդ փորձարկման համար:
Այս ուսումնասիրության ընթացքում ձեռք բերված կամ վերլուծված բոլոր տվյալները ներառված են հրապարակված հոդվածում և լրացուցիչ տեղեկատվական ֆայլերում: