Յոդի և ավերմեկտինի գնահատումը որպես սոճու նեմատոդային հիվանդության ինդուկտորներ

Սոճու նեմատոդը կարանտինային միգրացիոն էնդոմակաբուծ է, որը հայտնի է սոճու անտառային էկոհամակարգերում լուրջ տնտեսական վնասներ պատճառելով: Այս ուսումնասիրությունը վերանայում է հալոգենացված ինդոլների նեմատոդների դեմ նեմատոդների ակտիվությունը և դրանց գործողության մեխանիզմը: 5-յոդոինդոլի և ավերմեկտինի (դրական վերահսկողություն) նեմատոդների դեմ նեմատոդների ակտիվությունը նման էր և բարձր ցածր կոնցենտրացիաներում (10 մկգ/մլ): 5-յոդոինդոլը նվազեցրեց պտղաբերությունը, վերարտադրողական ակտիվությունը, սաղմնային և թրթուրային մահացությունը, ինչպես նաև շարժողական վարքագիծը: Լիգանդների մոլեկուլային փոխազդեցությունները անողնաշարավորների համար հատուկ գլուտամատ-կախյալ քլորիդային անցուղիների ընկալիչների հետ հաստատում են այն գաղափարը, որ 5-յոդոինդոլը, ինչպես ավերմեկտինը, ամուր կապվում է ընկալիչի ակտիվ կենտրոնի հետ: 5-յոդոինդոլը նաև առաջացրեց տարբեր ֆենոտիպային դեֆորմացիաներ նեմատոդների մոտ, ներառյալ օրգանների աննորմալ փլուզումը/կծկումը և վակուոլացման աճը: Այս արդյունքները ենթադրում են, որ վակուոլները կարող են դեր ունենալ նեմատոդների մեթիլացման միջոցով մահվան մեջ: Կարևոր է նշել, որ 5-յոդոինդոլը թունավոր չէր երկու բուսատեսակների (կաղամբ և բողկ) համար։ Այսպիսով, այս ուսումնասիրությունը ցույց է տալիս, որ յոդոինդոլի կիրառումը շրջակա միջավայրի պայմաններում կարող է վերահսկել սոճու թառամման վնասը։
Սոճու փայտի նեմատոդը (Bursaphelenchus xylophilus) պատկանում է սոճու փայտի նեմատոդներին (ՍՓՆ), որոնք միգրացիոն էնդոպարազիտային նեմատոդներ են, որոնք հայտնի են սոճու անտառի էկոհամակարգերին լուրջ էկոլոգիական վնաս հասցնելու իրենց հատկությամբ1: Սոճու փայտի նեմատոդի կողմից առաջացած սոճու թառամումը (ՍՓՀ) լուրջ խնդիր է դառնում մի քանի մայրցամաքներում, այդ թվում՝ Ասիայում և Եվրոպայում, իսկ Հյուսիսային Ամերիկայում նեմատոդը ոչնչացնում է ներմուծված սոճու տեսակները1,2: Սոճու ծառերի անկումը լուրջ տնտեսական խնդիր է, և դրա համաշխարհային տարածման հեռանկարը մտահոգիչ է3: Նեմատոդի կողմից առավել հաճախ հարձակվում են հետևյալ սոճու տեսակները՝ Pinus densiflora, Pinus sylvestris, Pinus thunbergii, Pinus koraiensis, Pinus thunbergii, Pinus thunbergii և Pinus radiata4: Սոճու նեմատոդը լուրջ հիվանդություն է, որը կարող է սպանել սոճիները վարակվելուց հետո շաբաթների կամ ամիսների ընթացքում: Բացի այդ, սոճու նեմատոդների բռնկումները տարածված են տարբեր էկոհամակարգերում, ուստի հաստատվել են վարակի կայուն շղթաներ1:
Bursaphelenchus xylophilus-ը կարանտինային բույսերի մակաբույծ նեմատոդ է, որը պատկանում է Aphelenchoidea գերընտանիքին և 102.5 կլադին: Նեմատոդը սնվում է սնկերով և բազմանում է սոճիների փայտի հյուսվածքներում՝ զարգանալով չորս տարբեր թրթուրային փուլերով՝ L1, L2, L3, L4 և չափահաս անհատ1,6: Սննդի պակասի պայմաններում սոճու նեմատոդը անցնում է մասնագիտացված թրթուրային փուլի՝ դաուերի, որը մակաբուծում է իր վեկտորին՝ սոճու կեղևի բզեզին (Monochamus alternatus) և փոխանցվում առողջ սոճիներին: Առողջ տերերի մոտ նեմատոդները արագորեն միգրացվում են բույսերի հյուսվածքներով և սնվում պարենքիմատոզ բջիջներով, ինչը հանգեցնում է մի շարք գերզգայունության ռեակցիաների, սոճու թառամման և մահվան վարակվելուց հետո մեկ տարվա ընթացքում1,7,8:
Սոճու նեմատոդների կենսաբանական վերահսկողությունը վաղուց մարտահրավեր է եղել, քանի որ կարանտինային միջոցառումները սկիզբ են առել դեռևս 20-րդ դարից: Սոճու նեմատոդների վերահսկման ներկայիս ռազմավարությունները հիմնականում ներառում են քիմիական մշակումներ, ներառյալ փայտի ֆումիգացիան և նեմատիցիդների տեղադրումը ծառերի բներում: Ամենատարածված օգտագործվող նեմատիցիդներն են ավերմեկտինը և ավերմեկտին բենզոատը, որոնք պատկանում են ավերմեկտինների ընտանիքին: Այս թանկարժեք քիմիական նյութերը խիստ արդյունավետ են նեմատոդների բազմաթիվ տեսակների դեմ և համարվում են էկոլոգիապես անվտանգ9: Այնուամենայնիվ, այս նեմատիցիդների կրկնակի օգտագործումը, ենթադրաբար, կստեղծի ընտրության ճնշում, որը գրեթե անկասկած կհանգեցնի դիմացկուն սոճու նեմատոդների ի հայտ գալուն, ինչպես ցույց է տրվել մի շարք միջատների վնասատուների դեպքում, ինչպիսիք են Leptinotarsa ​​​​decemlineata-ն, Plutella xylostella-ն և Trichostrongylus colubriformis-ը և Ostertagia circumcincta-ն, որոնք աստիճանաբար դիմացկունություն են զարգացրել ավերմեկտինների նկատմամբ10,11,12: Հետևաբար, դիմադրության ձևերը պետք է պարբերաբար ուսումնասիրվեն, իսկ նեմատիցիդները անընդհատ ստուգվեն՝ PVD-ի վերահսկման այլընտրանքային, ծախսարդյունավետ և էկոլոգիապես մաքուր միջոցներ գտնելու համար: Վերջին տասնամյակներում մի շարք հեղինակներ առաջարկել են բույսերի քաղվածքների, եթերային յուղերի և ցնդող նյութերի օգտագործումը որպես նեմատոդների դեմ պայքարի միջոցներ13,14,15,16:
Վերջերս մենք ցույց տվեցինք ինդոլի՝ միջբջջային և միջթագավորական ազդանշանային մոլեկուլի, նեմատասպան ակտիվությունը Caenorhabditis elegans-ում17: Ինդոլը մանրէային էկոլոգիայում լայնորեն տարածված ներբջջային ազդանշան է, որը վերահսկում է բազմաթիվ գործառույթներ, որոնք ազդում են մանրէային ֆիզիոլոգիայի, սպորների առաջացման, պլազմիդների կայունության, դեղերի նկատմամբ դիմադրության, կենսաթաղանթի առաջացման և վիրուլենտության վրա18, 19: Ինդոլի և դրա ածանցյալների ակտիվությունը այլ պաթոգեն նեմատոդների դեմ չի ուսումնասիրվել: Այս ուսումնասիրության մեջ մենք ուսումնասիրեցինք 34 ինդոլների նեմատասպան ակտիվությունը սոճու նեմատոդների դեմ և պարզաբանեցինք ամենաուժեղ 5-յոդոինդոլի գործողության մեխանիզմը՝ օգտագործելով մանրադիտակ, ժամանակի ընթացքում լուսանկարչություն և մոլեկուլային դոկինգի փորձեր, և գնահատեցինք դրա թունավոր ազդեցությունը բույսերի վրա՝ օգտագործելով սերմերի ծլման փորձ:
Նախկինում հաղորդվել է, որ ինդոլի բարձր կոնցենտրացիաները (>1.0 մՄ) ունեն նեմատոդների վրա նեմատոդների դեմ նեմատոդասպան ազդեցություն17: B. xylophilus-ի (խառը կյանքի փուլեր) ինդոլով կամ 33 տարբեր ինդոլի ածանցյալներով 1 մՄ կոնցենտրացիայով մշակումից հետո, B. xylophilus-ի մահացությունը չափվել է՝ հաշվելով կենդանի և մահացած նեմատոդները վերահսկիչ և բուժված խմբերում: Հինգ ինդոլ ցուցաբերել են նշանակալի նեմատոդասպան ակտիվություն. չմշակված վերահսկիչ խմբի գոյատևումը 24 ժամ անց կազմել է 95 ± 7%: Փորձարկված 34 ինդոլներից 5-իոդոինդոլը և 4-ֆտորինդոլը 1 մՄ կոնցենտրացիայով առաջացրել են 100% մահացություն, մինչդեռ 5,6-դիֆտորինդիգոն, մեթիլինդոլ-7-կարբօքսիլատը և 7-իոդինդոլը առաջացրել են մոտավորապես 50% մահացություն (աղյուսակ 1):
5-յոդոինդոլի ազդեցությունը սոճու փայտի նեմատոդի վակուոլների առաջացման և նյութափոխանակության վրա: (A) Ավերմեկտինի և 5-յոդոինդոլի ազդեցությունը չափահաս արու նեմատոդների վրա, (B) L1 փուլի նեմատոդի ձվերը և (C) B. xylophilus-ի նյութափոխանակությունը, (i) վակուոլներ չեն դիտարկվել 0 ժամվա ընթացքում, մշակումը հանգեցրել է (ii) վակուոլների, (iii) բազմաթիվ վակուոլների կուտակման, (iv) վակուոլների այտուցի, (v) վակուոլների միաձուլման և (vi) հսկա վակուոլների առաջացման: Կարմիր նետերը ցույց են տալիս վակուոլների այտուցը, կապույտ նետերը՝ վակուոլների միաձուլումը, իսկ սև նետերը՝ հսկա վակուոլները: Չափի սանդղակը = 50 մկմ:
Բացի այդ, այս ուսումնասիրությունը նկարագրել է նաև սոճու նեմատոդների մեթանի առաջացրած մահվան հաջորդական գործընթացը (Նկար 4C): Մեթանոգեն մահը բջջային մահվան ոչ ապոպտոտիկ տեսակ է, որը կապված է աչքի ընկնող ցիտոպլազմային վակուոլների կուտակման հետ27: Սոճու նեմատոդների մոտ դիտարկվող ձևաբանական արատները, կարծես, սերտորեն կապված են մեթանի առաջացրած մահվան մեխանիզմի հետ: Տարբեր ժամանակներում մանրադիտակային հետազոտությունը ցույց է տվել, որ հսկա վակուոլներ են ձևավորվել 5-յոդոինդոլի (0.1 մՄ) 20 ժամ ազդեցությունից հետո: Մանրադիտակային վակուոլներ դիտվել են 8 ժամ մշակումից հետո, և դրանց քանակը ավելացել է 12 ժամ հետո: Մի քանի մեծ վակուոլներ դիտվել են 14 ժամ հետո: Մի քանի միաձուլված վակուոլներ հստակ տեսանելի են եղել 12-16 ժամ մշակումից հետո, ինչը ցույց է տալիս, որ վակուոլների միաձուլումը մեթանի առաջացրած մահվան մեխանիզմի հիմքն է: 20 ժամ անց որդում հայտնաբերվել են մի քանի հսկա վակուոլներ: Այս դիտարկումները ներկայացնում են C. elegans-ի մոտ մետուոզի առաջին դեպքը:
5-յոդոինդոլով մշակված որդերի մոտ նկատվել է նաև վակուոլների ագրեգացիա և պատռվածք (Նկար 5), ինչի մասին վկայում են որդերի ծռումը և վակուոլների արտազատումը շրջակա միջավայր: Վակուոլների խզում նկատվել է նաև ձվի կճեպի թաղանթում, որը սովորաբար L2-ը պահպանում է ամբողջականություն ձվից դուրս գալու ընթացքում (Լրացուցիչ նկար S2): Այս դիտարկումները հաստատում են հեղուկի կուտակման և օսմոկարգավորման անբավարարության, ինչպես նաև շրջելի բջջային վնասվածքի (RCI) ներգրավվածությունը վակուոլների առաջացման և թարախակալման գործընթացում (Նկար 5):
Դիտարկված վակուոլների առաջացման մեջ յոդի դերի վարկածով, մենք ուսումնասիրեցինք նատրիումի յոդիդի (NaI) և կալիումի յոդիդի (KI) նեմատասպան ակտիվությունը: Այնուամենայնիվ, կոնցենտրացիաներում (0.1, 0.5 կամ 1 մՄ) դրանք չեն ազդել ո՛չ նեմատոդների գոյատևման, ո՛չ էլ վակուոլների առաջացման վրա (Լրացուցիչ նկար S5), չնայած 1 մՄ KI-ն ունեցել է թույլ նեմատասպան ազդեցություն: Մյուս կողմից, 7-յոդոինդոլը (1 կամ 2 մՄ), ինչպես 5-յոդոինդոլը, առաջացրել է բազմակի վակուոլներ և կառուցվածքային դեֆորմացիաներ (Լրացուցիչ նկար S6): Երկու յոդոինդոլները ցույց են տվել նմանատիպ ֆենոտիպային բնութագրեր սոճու նեմատոդներում, մինչդեռ NaI-ը և KI-ն՝ ոչ: Հետաքրքիր է, որ ինդոլը չի ​​առաջացրել վակուոլների առաջացում B. xylophilus-ում փորձարկված կոնցենտրացիաներում (տվյալները չեն ներկայացված): Այսպիսով, արդյունքները հաստատեցին, որ ինդոլ-յոդ համալիրը պատասխանատու է B. xylophilus-ի վակուոլացման և նյութափոխանակության համար:
Նեմատիցիդային ակտիվության համար փորձարկված ինդոլների շարքում 5-յոդոինդոլն ուներ ամենաբարձր սահքի ինդեքսը՝ -5.89 կկալ/մոլ, որին հաջորդում էին 7-յոդոինդոլը (-4.48 կկալ/մոլ), 4-ֆտորինդոլը (-4.33) և ինդոլը (-4.03) (Նկար 6): 5-յոդոինդոլի և լեյցին 218-ի միջև ամուր հիմքային ջրածնային կապը կայունացնում է դրա կապը, մինչդեռ մյուս բոլոր ինդոլի ածանցյալները կապվում են սերին 260-ի հետ՝ կողմնակի շղթայական ջրածնային կապերի միջոցով: Մոդելավորված այլ յոդոինդոլների շարքում, 2-յոդոինդոլն ունի -5.248 կկալ/մոլ կապի արժեք, որը պայմանավորված է լեյցին 218-ի հետ նրա հիմնական ջրածնային կապով: Այլ հայտնի կապերի թվում են 3-յոդոինդոլը (-4.3 կկալ/մոլ), 4-յոդոինդոլը (-4.0 կկալ/մոլ) և 6-ֆտորինդոլը (-2.6 կկալ/մոլ) (Լրացուցիչ նկար S8): Հալոգենացված ինդոլների մեծ մասը և ինդոլն ինքնին, բացառությամբ 5-յոդոինդոլի և 2-յոդոինդոլի, կապ են առաջացնում սերին 260-ի հետ: Այն փաստը, որ լեյցին 218-ի հետ ջրածնային կապը վկայում է ընկալիչ-լիգանդ արդյունավետ կապի մասին, ինչպես դիտվել է իվերմեկտինի դեպքում (Լրացուցիչ նկ. S7), հաստատում է, որ 5-յոդոինդոլը և 2-յոդոինդոլը, ինչպես իվերմեկտինը, ամուր կապվում են GluCL ընկալիչի ակտիվ կենտրոնի հետ լեյցին 218-ի միջոցով (Նկ. 6 և Լրացուցիչ նկ. S8): Մենք ենթադրում ենք, որ այս կապը անհրաժեշտ է GluCL համալիրի բաց ծակոտիների կառուցվածքը պահպանելու համար, և որ GluCL ընկալիչի ակտիվ կենտրոնի հետ ամուր կապվելով՝ 5-յոդոինդոլը, 2-յոդոինդոլը, ավերմեկտինը և իվերմեկտինը այդպիսով բաց են պահում իոնային անցուղին և թույլ են տալիս հեղուկի կլանումը:
Ինդոլի և հալոգենացված ինդոլի մոլեկուլային կապը GluCL-ի հետ։ (A) ինդոլի, (B) 4-ֆտորինդոլի, (C) 7-իոդինդոլի և (D) 5-իոդինդոլի լիգանդների կապի կողմնորոշումները GluCL-ի ակտիվ կենտրոնին։ Սպիտակուցը ներկայացված է ժապավենով, իսկ հիմնական ջրածնային կապերը ցույց են տրված դեղին կետավոր գծերով։ (A′), (B′), (C′) և (D′)-ները ցույց են տալիս համապատասխան լիգանդների փոխազդեցությունները շրջակա ամինաթթվային մնացորդների հետ, իսկ կողմնակի շղթայի ջրածնային կապերը ցույց են տրված վարդագույն կետավոր նետերով։
Փորձեր են անցկացվել կաղամբի և բողկի սերմերի ծլման վրա 5-յոդոյինդոլի թունավոր ազդեցությունը գնահատելու համար: 5-յոդոյինդոլը (0.05 կամ 0.1 մՄ) կամ ավերմեկտինը (10 մկգ/մլ) քիչ կամ ընդհանրապես ազդեցություն չեն ունեցել սկզբնական ծլման և բողբոջի ի հայտ գալու վրա (Նկար 7): Բացի այդ, չմշակված վերահսկիչ խմբի և 5-յոդոյինդոլով կամ ավերմեկտինով մշակված սերմերի ծլման արագության միջև էական տարբերություն չի հայտնաբերվել: Հիմնական արմատի երկարացման և ձևավորված կողմնային արմատների քանակի վրա ազդեցությունը աննշան էր, չնայած 5-յոդոյինդոլի 1 մՄ-ը (ակտիվ կոնցենտրացիայի 10-ապատիկը) փոքր-ինչ հետաձգել է կողմնային արմատների զարգացումը: Այս արդյունքները ցույց են տալիս, որ 5-յոդոյինդոլը ոչ թունավոր է բույսերի բջիջների համար և չի խանգարում բույսերի զարգացման գործընթացներին ուսումնասիրված կոնցենտրացիաներում:
5-յոդոինդոլի ազդեցությունը սերմերի ծլման վրա: B. oleracea և R. raphanistrum սերմերի ծլումը, ծլումը և կողմնային արմատավորումը Մուրաշիգեի և Սկուգի ագարի միջավայրում՝ ավերմեկտինով կամ 5-յոդոինդոլով կամ առանց դրանց: Ծլումը գրանցվել է 22°C ջերմաստիճանում 3 օրվա ինկուբացիայից հետո:
Այս ուսումնասիրությունը ներկայացնում է նեմատոդների ոչնչացման մի քանի դեպք ինդոլների կողմից: Կարևոր է նշել, որ սա սոճու ասեղներում յոդոինդոլի կողմից մեթիլացման (փոքր վակուոլների կուտակման հետևանքով առաջացող գործընթաց, որոնք աստիճանաբար միաձուլվում են հսկա վակուոլների, ինչը ի վերջո հանգեցնում է թաղանթի պատռման և մահվան) առաջին դեպքն է, որտեղ յոդոինդոլը ցուցաբերում է նշանակալի նեմատոդասպան հատկություններ, որոնք նման են առևտրային նեմատոդասպան ավերմեկտինի հատկություններին:
Նախկինում հաղորդվել է, որ ինդոլները պրոկարիոտներում և էուկարիոտներում իրականացնում են բազմաթիվ ազդանշանային գործառույթներ, ներառյալ կենսաթաղանթի արգելակումը/ձևավորումը, մանրէների գոյատևումը և պաթոգենությունը19,32,33,34: Վերջերս հալոգենացված ինդոլների, ինդոլի ալկալոիդների և կիսասինթետիկ ինդոլի ածանցյալների պոտենցիալ թերապևտիկ ազդեցությունները գրավել են լայն հետազոտական ​​հետաքրքրություն35,36,37: Օրինակ, հալոգենացված ինդոլները, ինչպես ցույց է տրվել, սպանում են Escherichia coli-ի և Staphylococcus aureus-ի կայուն բջիջները37: Բացի այդ, գիտական ​​հետաքրքրություն է ներկայացնում հալոգենացված ինդոլների արդյունավետության ուսումնասիրությունը այլ տեսակների, սեռերի և թագավորությունների դեմ, և այս ուսումնասիրությունը քայլ է դեպի այս նպատակին հասնելը:
Այստեղ մենք առաջարկում ենք C. elegans-ի մոտ 5-յոդոինդոլի առաջացրած մահացության մեխանիզմ՝ հիմնված բջջային շրջելի վնասվածքի (RCI) և մեթիլացման վրա (Նկարներ 4C և 5): Այտուցային փոփոխությունները, ինչպիսիք են այտուցվածությունը և վակուոլային դեգեներացիան, RCI-ի և մեթիլացման ցուցանիշներ են, որոնք դրսևորվում են ցիտոպլազմայում հսկա վակուոլների տեսքով48,49: RCI-ն խանգարում է էներգիայի արտադրությանը՝ նվազեցնելով ԱԵՖ-ի արտադրությունը, առաջացնելով ԱԵՖազայի պոմպի խափանում կամ խաթարելով բջջային թաղանթները և առաջացնելով Na+, Ca2+ և ջրի արագ հոսք50,51,52: Ներցիտոպլազմային վակուոլները առաջանում են կենդանիների բջիջներում ցիտոպլազմայում հեղուկի կուտակման հետևանքով՝ Ca2+ և ջրի հոսքի պատճառով53: Հետաքրքիր է, որ բջջային վնասման այս մեխանիզմը շրջելի է, եթե վնասը ժամանակավոր է, և բջիջները սկսում են որոշակի ժամանակահատվածում արտադրել ԱԵՖ, բայց եթե վնասը շարունակվում կամ վատթարանում է, բջիջները մահանում են:54 Մեր դիտարկումները ցույց են տալիս, որ 5-յոդոինդոլով բուժված նեմատոդները չեն կարողանում վերականգնել նորմալ կենսասինթեզը սթրեսային պայմանների ենթարկվելուց հետո:
B. xylophilus-ում 5-յոդոինդոլի կողմից առաջացած մեթիլացման ֆենոտիպը կարող է պայմանավորված լինել յոդի առկայությամբ և դրա մոլեկուլային բաշխմամբ, քանի որ 7-յոդոինդոլը B. xylophilus-ի վրա ավելի քիչ արգելակող ազդեցություն ունի, քան 5-յոդոինդոլը (աղյուսակ 1 և լրացուցիչ նկար S6): Այս արդյունքները մասամբ համապատասխանում են Maltese et al. (2014)-ի ուսումնասիրություններին, որոնք հայտնել են, որ ինդոլում պիրիդիլ ազոտի մասնիկի տեղափոխումը պարա-ից մետա- դիրք վերացրել է վակուոլացումը, աճի արգելակումը և ցիտոտոքսիկությունը U251 բջիջներում, ինչը ենթադրում է, որ մոլեկուլի փոխազդեցությունը սպիտակուցի որոշակի ակտիվ կենտրոնի հետ կարևոր է27,44,45: Այս ուսումնասիրության մեջ դիտարկված ինդոլի կամ հալոգենացված ինդոլների և GluCL ընկալիչների միջև փոխազդեցությունները նույնպես հաստատում են այս տեսակետը, քանի որ պարզվել է, որ 5- և 2-յոդոինդոլները ավելի ուժեղ են կապվում GluCL ընկալիչների հետ, քան մյուս ուսումնասիրված ինդոլները (նկար 6 և լրացուցիչ նկար S8): Ինդոլի երկրորդ կամ հինգերորդ դիրքում գտնվող յոդը կապվում է GluCL ընկալիչի լեյցին 218-ի հետ՝ ողնաշարային ջրածնային կապերի միջոցով, մինչդեռ այլ հալոգենացված ինդոլները և ինդոլն ինքնին թույլ կողմնակի շղթայական ջրածնային կապեր են առաջացնում սերին 260-ի հետ (Նկար 6): Հետևաբար, մենք ենթադրում ենք, որ հալոգենի տեղայնացումը կարևոր դեր է խաղում վակուոլային դեգեներացիայի առաջացման գործում, մինչդեռ 5-յոդոինդոլի ամուր կապը իոնային անցուղին բաց է պահում, դրանով իսկ թույլ տալով հեղուկի արագ հոսք և վակուոլների պատռվածք: Այնուամենայնիվ, 5-յոդոինդոլի գործողության մանրամասն մեխանիզմը դեռ պետք է որոշվի:
Մինչև 5-յոդոինդոլի գործնական կիրառումը, պետք է վերլուծվի դրա թունավոր ազդեցությունը բույսերի վրա: Մեր սերմերի ծլման փորձերը ցույց տվեցին, որ ուսումնասիրված կոնցենտրացիաներում 5-յոդոինդոլը բացասական ազդեցություն չի ունեցել սերմերի ծլման կամ հետագա զարգացման գործընթացների վրա (Նկար 7): Այսպիսով, այս ուսումնասիրությունը հիմք է հանդիսանում էկոլոգիական միջավայրում 5-յոդոինդոլի օգտագործման համար՝ սոճու նեմատոդների վնասակարությունը սոճու ծառերի համար վերահսկելու համար:
Նախորդ զեկույցները ցույց են տվել, որ ինդոլի վրա հիմնված թերապիան ներկայացնում է հակաբիոտիկների նկատմամբ կայունության և քաղցկեղի առաջընթացի խնդիրը լուծելու պոտենցիալ մոտեցում55: Բացի այդ, ինդոլներն ունեն հակաբակտերիալ, հակաքաղցկեղային, հակաօքսիդանտային, հակաբորբոքային, հակադիաբետիկ, հակավիրուսային, հակապրոլիֆերատիվ և հակատուբերկուլյոզային ակտիվություն և կարող են ծառայել որպես խոստումնալից հիմք դեղերի մշակման համար56,57: Այս ուսումնասիրությունն առաջին անգամ ենթադրում է յոդի հնարավոր օգտագործումը որպես հակամակաբուծային և հակահելմինթային միջոց:
Ավերմեկտինը հայտնաբերվել է երեք տասնամյակ առաջ և արժանացել է Նոբելյան մրցանակի 2015 թվականին, և դրա օգտագործումը որպես հակահելմինտիկ միջոց դեռևս ակտիվորեն շարունակվում է: Այնուամենայնիվ, նեմատոդների և միջատների վնասատուների մոտ ավերմեկտինների նկատմամբ դիմադրության արագ զարգացման պատճառով, սոճիների մոտ PWN վարակը վերահսկելու համար անհրաժեշտ է այլընտրանքային, ցածր գնով և էկոլոգիապես մաքուր ռազմավարություն: Այս ուսումնասիրությունը նաև ներկայացնում է այն մեխանիզմը, որով 5-յոդոյնդոլը սպանում է սոճու նեմատոդներին, և որ 5-յոդոյնդոլը ցածր թունավորություն ունի բույսերի բջիջների համար, ինչը լավ հեռանկարներ է բացում դրա ապագա առևտրային կիրառման համար:
Բոլոր փորձերը հաստատվել են Կորեայի Կյոնսան քաղաքի Յոնգնամ համալսարանի էթիկայի կոմիտեի կողմից, և մեթոդները կատարվել են Յոնգնամ համալսարանի էթիկայի կոմիտեի ուղեցույցներին համապատասխան։
Ձվերի ինկուբացիոն փորձերը կատարվել են սահմանված ընթացակարգերով43: Ձվից դուրս գալու արագությունը (ՀԱ) գնահատելու համար 1 օրական չափահաս նեմատոդները (մոտավորապես 100 էգ և 100 արու) տեղափոխվել են սնկով պարունակվող Պետրիի ամանների մեջ և թողնվել են աճել 24 ժամ: Այնուհետև ձվերը մեկուսացվել և մշակվել են 5-յոդոինդոլով (0.05 մՄ և 0.1 մՄ) կամ ավերմեկտինով (10 մկգ/մլ)՝ որպես ստերիլ թորած ջրի մեջ սուսպենզիա: Այս սուսպենզիաները (500 մկլ; մոտավորապես 100 ձու) տեղափոխվել են 24-փոսանոց հյուսվածքային կուլտուրայի ափսեի փոսիկներ և ինկուբացվել 22°C ջերմաստիճանում: L2 հաշվարկները կատարվել են 24 ժամ ինկուբացիայից հետո, բայց համարվում են մեռած, եթե բջիջները չեն շարժվել բարակ պլատինե մետաղալարով խթանելիս: Այս փորձը անցկացվել է երկու փուլով՝ յուրաքանչյուրը վեց կրկնությամբ: Երկու փորձերի տվյալները համակցվել և ներկայացվել են: ՀԱ-ի տոկոսը հաշվարկվում է հետևյալ կերպ.
Թրթուրների մահացությունը գնահատվել է նախկինում մշակված ընթացակարգերի միջոցով: Նեմատոդների ձվերը հավաքվել են, և սաղմերը համաժամեցվել են՝ դուրս գալով ստերիլ թորած ջրում՝ L2 փուլի թրթուրներ ստանալու համար: Սինխրոնացված թրթուրները (մոտավորապես 500 նեմատոդ) մշակվել են 5-յոդոինդոլով (0.05 մՄ և 0.1 մՄ) կամ ավերմեկտինով (10 մկգ/մլ) և մեծացվել են B. cinerea Պետրիի թիթեղների վրա: 22°C ջերմաստիճանում 48 ժամ ինկուբացիայից հետո նեմատոդները հավաքվել են ստերիլ թորած ջրում և հետազոտվել L2, L3 և L4 փուլերի առկայության համար: L3 և L4 փուլերի առկայությունը ցույց է տվել թրթուրային տրանսֆորմացիա, մինչդեռ L2 փուլի առկայությունը ցույց է տվել տրանսֆորմացիայի բացակայություն: Պատկերները ստացվել են iRiS™ թվային բջջային պատկերման համակարգի միջոցով: Այս փորձը անցկացվել է երկու փուլով՝ յուրաքանչյուրը վեց կրկնությամբ: Երկու փորձերի տվյալները համակցվել և ներկայացվել են:
5-յոդոինդոլի և ավերմեկտինի թունավորությունը սերմերի համար գնահատվել է Մուրաշիգեի և Սկուգի ագարի թիթեղների վրա բողբոջման թեստերի միջոցով:62 B. oleracea և R. raphanistrum սերմերը նախ մեկ օր թրջվել են ստերիլ թորած ջրի մեջ, լվացվել են 1 մլ 100% էթանոլով, 15 րոպե ստերիլացվել են 1 մլ 50% առևտրային սպիտակեցնողով (3% նատրիումի հիպոքլորիտ) և հինգ անգամ լվացվել են 1 մլ ստերիլ ջրով: Այնուհետև ստերիլիզացված սերմերը սեղմվել են բողբոջման ագարի թիթեղների վրա, որոնք պարունակում էին 0.86 գ/լ (0.2X) Մուրաշիգեի և Սկուգի միջավայր և 0.7% մանրէաբանական ագար՝ 5-յոդոինդոլով կամ ավերմեկտինով կամ առանց դրա: Այնուհետև թիթեղները ինկուբացվել են 22°C ջերմաստիճանում, և պատկերները արվել են 3 օրվա ինկուբացիայից հետո: Այս փորձը կատարվել է երկու փուլով, որոնցից յուրաքանչյուրը ունեցել է վեց կրկնություն: