Յոդի և ավերմեկտինի գնահատումը որպես սոճու նեմատոդային հիվանդության ինդուկտորներ

Սոճու նեմատոդը կարանտինային միգրացիոն էնդոպարազիտ է, որը հայտնի է սոճու անտառային էկոհամակարգերում լուրջ տնտեսական վնասներ պատճառելով: Սույն ուսումնասիրությունը վերանայում է հալոգենացված ինդոլների նեմատիցիդային ակտիվությունը սոճու նեմատոդների նկատմամբ և դրանց գործողության մեխանիզմը: 5-յոդոինդոլի և ավերմեկտինի (դրական հսկողություն) նեմատիցիդային գործունեությունը սոճու նեմատոդների նկատմամբ նման էր և բարձր ցածր կոնցենտրացիաներում (10 մկգ/մլ): 5-յոդոինդոլը նվազեցնում է պտղաբերությունը, վերարտադրողական ակտիվությունը, սաղմնային և թրթուրների մահացությունը և շարժողական վարքագիծը: Լիգանդների մոլեկուլային փոխազդեցությունները անողնաշարավորներին հատուկ գլյուտամատով փակված քլորիդային ալիքների ընկալիչների հետ հաստատում են այն գաղափարը, որ 5-յոդոինդոլը, ինչպես ավերմեկտինը, սերտորեն կապվում է ընկալիչների ակտիվ վայրի հետ: 5-յոդոնդոլը նաև առաջացրել է նեմատոդների տարբեր ֆենոտիպային դեֆորմացիաներ, ներառյալ օրգանների աննորմալ կոլապս/փոքրացում և վակուոլիզացիայի ավելացում: Այս արդյունքները ցույց են տալիս, որ վակուոլները կարող են դեր խաղալ նեմատոդների մեթիլացման միջնորդավորված մահվան մեջ: Կարևոր է, որ 5-յոդոինդոլը թունավոր չէր երկու բույսերի տեսակների համար (կաղամբ և բողկ): Այսպիսով, այս ուսումնասիրությունը ցույց է տալիս, որ յոդոնդոլի կիրառումը շրջակա միջավայրի պայմաններում կարող է վերահսկել սոճու թառամածության վնասվածքը:
Սոճու փայտի նեմատոդը (Bursaphelenchus xylophilus) պատկանում է սոճու փայտի նեմատոդներին (PWN), միգրացիոն էնդոպարազիտային նեմատոդներին, որոնք հայտնի են, որ լուրջ էկոլոգիական վնաս են հասցնում սոճու անտառային էկոհամակարգերին1: Սոճու թառամածության հիվանդությունը (PWD), որն առաջանում է սոճու փայտի նեմատոդից, լուրջ խնդիր է դառնում մի քանի մայրցամաքներում, ներառյալ Ասիան և Եվրոպան, իսկ Հյուսիսային Ամերիկայում նեմատոդը ոչնչացնում է ներմուծված սոճու տեսակները1,2: Սոճու ծառերի անկումը մեծ տնտեսական խնդիր է, և դրա համաշխարհային տարածման հեռանկարը մտահոգիչ է3: Նեմատոդից առավել հաճախ հարձակվում են սոճու հետևյալ տեսակները՝ Pinus densiflora, Pinus sylvestris, Pinus thunbergii, Pinus koraiensis, Pinus thunbergii, Pinus thunbergii և Pinus radiata4: Սոճու նեմատոդը լուրջ հիվանդություն է, որը կարող է սպանել սոճին վարակվելուց հետո շաբաթների կամ ամիսների ընթացքում: Բացի այդ, սոճու նեմատոդների բռնկումները տարածված են մի շարք էկոհամակարգերում, ուստի հաստատվել են վարակի մշտական ​​շղթաներ1:
Bursaphelenchus xylophilus-ը կարանտինային բույս-մակաբույծ նեմատոդ է, որը պատկանում է Aphelenchoidea գերընտանիքին և 102.5 կլադին։ Նեմատոդը սնվում է սնկերով և բազմանում է սոճու ծառերի փայտային հյուսվածքներում՝ զարգանալով չորս տարբեր թրթուրների փուլերի՝ L1, L2, L3, L4 և չափահաս անհատ1,6: Սննդի դեֆիցիտի պայմաններում սոճու նեմատոդն անցնում է մասնագիտացված թրթուրային փուլի՝ դաուերի, որը մակաբուծում է իր վեկտորին՝ սոճու կեղևի բզեզին (Monochamus alternatus) և տեղափոխվում առողջ սոճու ծառեր։ Առողջ տանտերերի մոտ նեմատոդները արագ գաղթում են բույսերի հյուսվածքներով և սնվում պարենխիմատոզ բջիջներով, ինչը հանգեցնում է մի շարք գերզգայունության ռեակցիաների, սոճու թառամածության և մահվան վարակվելուց հետո մեկ տարվա ընթացքում1,7,8:
Սոճու նեմատոդների կենսաբանական հսկողությունը երկար ժամանակ մարտահրավեր է, կարանտինային միջոցառումները սկսվում են 20-րդ դարից: Սոճու նեմատոդների դեմ պայքարի ներկայիս ռազմավարությունները հիմնականում ներառում են քիմիական բուժում, ներառյալ փայտի թմրանյութը և նեմատիդների տեղադրումը ծառերի բների մեջ: Առավել հաճախ օգտագործվող նեմատիկիդներն են ավերմեկտինը և ավերմեկտին բենզոատը, որոնք պատկանում են ավերմեկտինների ընտանիքին։ Այս թանկարժեք քիմիական նյութերը շատ արդյունավետ են նեմատոդների բազմաթիվ տեսակների դեմ և համարվում են էկոլոգիապես անվտանգ9: Այնուամենայնիվ, ակնկալվում է, որ այս նեմատիդների կրկնակի օգտագործումը կստեղծի ընտրողական ճնշում, որը գրեթե անկասկած կհանգեցնի սոճու դիմացկուն նեմատոդների առաջացմանը, ինչպես ցույց է տրվել միջատների մի շարք վնասատուների համար, ինչպիսիք են Leptinotarsa' decemlineata, Plutella xylostella և Trichostrongylus colubriformis և Ostertagia-ի նկատմամբ աստիճանաբար դիմադրողականություն: ավերմեկտիններ10,11,12. Հետևաբար, դիմադրողականության օրինաչափությունները պետք է պարբերաբար ուսումնասիրվեն և նեմատիկիդները շարունակաբար զննվեն՝ PVD-ին վերահսկելու այլընտրանքային, ծախսարդյունավետ և էկոլոգիապես մաքուր միջոցներ գտնելու համար: Վերջին տասնամյակների ընթացքում մի շարք հեղինակներ առաջարկել են օգտագործել բույսերի քաղվածքները, եթերային յուղերը և ցնդող նյութերը որպես նեմատոդների դեմ պայքարող միջոցներ13,14,15,16:
Վերջերս մենք ցուցադրեցինք ինդոլի՝ միջբջջային և միջթագավորական ազդանշանային մոլեկուլի նեմատիկ ակտիվությունը Caenorhabditis elegans-ում 17: Ինդոլը մանրէների էկոլոգիայում տարածված ներբջջային ազդանշան է, որը վերահսկում է բազմաթիվ գործառույթներ, որոնք ազդում են մանրէների ֆիզիոլոգիայի, սպորների ձևավորման, պլազմիդի կայունության, դեղամիջոցների դիմադրության, բիոֆիլմի ձևավորման և վիրուլենտության վրա 18, 19: Ինդոլի և նրա ածանցյալների ակտիվությունը այլ պաթոգեն նեմատոդների նկատմամբ չի ուսումնասիրվել: Այս ուսումնասիրության մեջ մենք ուսումնասիրեցինք 34 ինդոլների նեմատիցիդային ակտիվությունը սոճու նեմատոդների դեմ և պարզեցինք ամենահզոր 5-յոդոինդոլի գործողության մեխանիզմը՝ օգտագործելով միկրոսկոպիա, ժամանակի անցումային լուսանկարչություն և մոլեկուլային ամրացման փորձեր, և գնահատեցինք դրա թունավոր ազդեցությունը բույսերի վրա՝ օգտագործելով սերմերի բողբոջման փորձարկումը:
Նախկինում հաղորդվել էր, որ ինդոլի բարձր կոնցենտրացիաների (> 1,0 մՄ) նեմատիդային ազդեցություն ունի նեմատոդների վրա17: B. xylophilus-ի (խառը կյանքի փուլեր) ինդոլով կամ 33 տարբեր ինդոլ ածանցյալներով բուժումից հետո 1 մՄ-ով, B. xylophilus-ի մահացությունը չափվել է հսկիչ և բուժվող խմբերում կենդանի և մահացած նեմատոդների հաշվման միջոցով: Հինգ ինդոլներ ցուցաբերեցին զգալի նեմատիցիդային ակտիվություն. չբուժված վերահսկիչ խմբի գոյատևումը 24 ժամ հետո կազմել է 95 ± 7%: Փորձարկված 34 ինդոլներից 5-յոդոինդոլը և 4-ֆտորինդոլը 1 մՄ-ով առաջացրել են 100% մահացություն, մինչդեռ 5,6-դիֆտորինդիգո, մեթիլինդոլ-7-կարբոքսիլատ և 7-յոդոինդոլ առաջացրել են մոտավորապես 50% մահացություն (Աղյուսակ 1):
5-յոդոինդոլի ազդեցությունը սոճու փայտի նեմատոդի վակուոլների ձևավորման և նյութափոխանակության վրա: (A) Ավերմեկտինի և 5-յոդոինդոլի ազդեցությունը հասուն արու նեմատոդների վրա, (B) L1 փուլի նեմատոդի ձվերը և (C) B. xylophilus-ի նյութափոխանակությունը, (i) վակուոլները չեն նկատվել 0 ժամում, բուժումը հանգեցրել է (ii) վակուոլների, (iii) վակուոլների կուտակմանը, (iii) վակուոլների կուտակմանը, (iv) վակուոլների միաձուլում և (vi) հսկա վակուոլների ձևավորում։ Կարմիր սլաքները ցույց են տալիս վակուոլների այտուցվածությունը, կապույտ սլաքները ցույց են տալիս վակուոլների միաձուլումը, իսկ սև սլաքները ցույց են տալիս հսկա վակուոլներ: Սանդղակի բար = 50 մկմ:
Բացի այդ, այս ուսումնասիրությունը նկարագրել է նաև սոճու նեմատոդներում մեթանից առաջացած մահվան հաջորդական գործընթացը (Նկար 4C): Մեթանոգեն մահը բջիջների մահվան ոչ ապոպտոտիկ տեսակ է, որը կապված է ցիտոպլազմիկ ակնառու վակուոլների կուտակման հետ27: Սոճու նեմատոդներում նկատված մորֆոլոգիական թերությունները կարծես սերտորեն կապված են մեթանից առաջացած մահվան մեխանիզմի հետ: Տարբեր ժամանակներում մանրադիտակային հետազոտությունը ցույց է տվել, որ հսկա վակուոլներ են գոյացել 5-յոդոինդոլի (0,1 մՄ) 20 ժամ ազդեցությունից հետո: Մանրադիտակային վակուոլներ են նկատվել բուժումից 8 ժամ հետո, իսկ 12 ժամ հետո դրանց թիվն աճել է: 14 ժամ հետո նկատվել են մի քանի խոշոր վակուոլներ: Բուժումից 12-16 ժամ հետո մի քանի միաձուլված վակուոլներ հստակ տեսանելի էին, ինչը ցույց է տալիս, որ վակուոլների միաձուլումը մեթանոգեն մահվան մեխանիզմի հիմքն է: 20 ժամ անց մի քանի հսկա վակուոլներ են հայտնաբերվել ճիճու ամբողջ տարածքում: Այս դիտարկումները ներկայացնում են մետուոզի առաջին զեկույցը C. elegans-ում:
5-յոդոինդոլով մշակված որդերի մոտ նկատվել է նաև վակուոլային ագրեգացիա և պատռվածք (նկ. 5), ինչի մասին վկայում են ճիճուների ծռումը և վակուոլի արտազատումը շրջակա միջավայր: Վակուոլի խախտում է նկատվել նաև ձվի կեղևի թաղանթում, որը սովորաբար պահպանվում է L2-ի կողմից անձեռնմխելիությունից դուրս գալու ժամանակ (Լրացուցիչ նկ. S2): Այս դիտարկումները աջակցում են հեղուկի կուտակման և օսմոկարգավորիչ ձախողման, ինչպես նաև շրջելի բջջային վնասվածքի (RCI) ներգրավմանը վակուոլների ձևավորման և թուլացման գործընթացում (նկ. 5):
Ենթադրելով յոդի դերը դիտարկված վակուոլի ձևավորման մեջ՝ մենք ուսումնասիրեցինք նատրիումի յոդիդի (NaI) և կալիումի յոդիդի (KI) նեմատիցիդային ակտիվությունը: Այնուամենայնիվ, կոնցենտրացիաներում (0.1, 0.5 կամ 1 մՄ) դրանք չեն ազդել ոչ նեմատոդների գոյատևման, ոչ էլ վակուոլների ձևավորման վրա (Լրացուցիչ նկ. S5), չնայած 1 մՄ KI-ն ունեցել է թեթև նեմատիդային ազդեցություն: Մյուս կողմից, 7-յոդոինդոլը (1 կամ 2 մՄ), ինչպես 5-յոդոինդոլը, առաջացրել է բազմաթիվ վակուոլներ և կառուցվածքային դեֆորմացիաներ (Լրացուցիչ նկ. S6): Երկու յոդոնդոլները սոճու նեմատոդներում ցույց են տվել նմանատիպ ֆենոտիպային բնութագրեր, մինչդեռ NaI-ը և KI-ն՝ ոչ: Հետաքրքիր է, որ ինդոլը չի ​​դրդել վակուոլի ձևավորումը B. xylophilus-ում փորձարկված կոնցենտրացիաներում (տվյալները ցույց չեն տրված): Այսպիսով, արդյունքները հաստատեցին, որ ինդոլ-յոդի համալիրը պատասխանատու է B. xylophilus-ի վակուոլացման և նյութափոխանակության համար:
Նեմատիցիդային ակտիվության համար փորձարկված ինդոլներից 5-յոդոինդոլն ուներ ամենաբարձր սայթաքման ինդեքսը՝ -5,89 կկալ/մոլ, որին հաջորդում են 7-յոդոինդոլը (-4,48 կկալ/մոլ), 4-ֆտորինդոլը (-4,33) և ինդոլը (-4,03) (Նկար 6): 5-յոդոինդոլի և լեյցին 218-ի ամուր ողնաշարային ջրածնային կապը կայունացնում է դրա կապը, մինչդեռ ինդոլի մյուս բոլոր ածանցյալները կապվում են սերին 260-ին կողային շղթայական ջրածնային կապերի միջոցով: Ի թիվս այլ մոդելավորված յոդոինդոլների, 2-յոդոինդոլն ունի -5,248 կկալ/մոլ կապող արժեք, ինչը պայմանավորված է լեյցինի 218-ի հետ նրա հիմնական ջրածնային կապով: Այլ հայտնի կապերը ներառում են 3-յոդոինդոլը (-4,3 կկալ/մոլ), 4-յոդոինդոլը (-4,0 կկալ/մոլ), և 6-իոդոինդոլը (-4,0 կկալ/մոլ): կկալ/մոլ) (Լրացուցիչ նկար S8): Հալոգենացված ինդոլների մեծ մասը և ինքը՝ ինդոլը, բացառությամբ 5-յոդոինդոլի և 2-յոդոինդոլի, կապ են կազմում սերին 260-ի հետ: Այն փաստը, որ ջրածնային կապը լեյցինի հետ 218-ի հետ ցույց է տալիս արդյունավետ ընկալիչ-լիգանդ կապը, ինչպես նկատվում է իվերմեկտինի համար (Լրացուցիչ նկ. 2-յոդոինդոլը, ինչպես և իվերմեկտինը, սերտորեն կապվում է GluCL ընկալիչի ակտիվ վայրի հետ լեյցինի 218-ի միջոցով (նկ. 6 և լրացուցիչ նկ. S8): Մենք առաջարկում ենք, որ այս կապը պահանջվում է GluCL համալիրի բաց ծակոտի կառուցվածքը պահպանելու համար և սերտորեն կապելով GluCL ընկալիչի ակտիվ տեղամասին, 5-յոդոինդոլին, 2-յոդոինդոլին, ավերմեկտինին և իվերմեկտինին, այդպիսով պահպանելով իոնային ալիքը բաց և թույլ տալով հեղուկ կլանումը:
Ինդոլի և հալոգենացված ինդոլի մոլեկուլային միացում GluCL-ին: (A) ինդոլի, (B) 4-ֆտորինդոլի, (C) 7-յոդոինդոլի և (D) 5-յոդոինդոլի լիգանդների միացման կողմնորոշումները GluCL-ի ակտիվ վայրում: Սպիտակուցը ներկայացված է ժապավենով, իսկ ողնաշարի ջրածնային կապերը՝ դեղին կետավոր գծերով։ (A'), (B'), (C') և (D') ցույց են տալիս համապատասխան լիգանների փոխազդեցությունները շրջակա ամինաթթուների մնացորդների հետ, իսկ կողային շղթայի ջրածնային կապերը նշված են վարդագույն կետավոր սլաքներով։
Փորձեր են իրականացվել՝ գնահատելու 5-յոդոինդոլի թունավոր ազդեցությունը կաղամբի և բողկի սերմերի բողբոջման վրա: 5-յոդոինդոլը (0,05 կամ 0,1 մՄ) կամ ավերմեկտինը (10 մկգ/մլ) քիչ ազդեցություն են ունեցել կամ բացակայել են սկզբնական բողբոջման և բողբոջների առաջացման վրա (Նկար 7): Բացի այդ, էական տարբերություն չի հայտնաբերվել չմշակված հսկիչների և 5-յոդոինդոլով կամ ավերմեկտինով մշակված սերմերի բողբոջման արագության միջև: Արմատի երկարացման և ձևավորված կողային արմատների քանակի վրա ազդեցությունը աննշան էր, թեև 1 մՄ (10 անգամ նրա ակտիվ կոնցենտրացիայից) 5-յոդոինդոլը մի փոքր հետաձգեց կողային արմատների զարգացումը: Այս արդյունքները ցույց են տալիս, որ 5-յոդոինդոլը ոչ թունավոր է բույսերի բջիջների համար և չի խանգարում բույսերի զարգացման գործընթացներին ուսումնասիրված կոնցենտրացիաներում:
5-յոդոինդոլի ազդեցությունը սերմերի բողբոջման վրա. B. oleracea-ի և R. raphanistrum-ի սերմերի բողբոջումը, բողբոջումը և կողային արմատավորումը Murashige և Skoog agar միջավայրում ավերմեկտինով կամ 5-յոդոինդոլով կամ առանց դրա: Բողբոջումը գրանցվել է 3 օր ինկուբացիայից հետո 22°C-ում:
Այս ուսումնասիրությունը հայտնում է ինդոլների կողմից նեմատոդների սպանության մի քանի դեպքեր: Կարևորն այն է, որ սա յոդոնդոլով առաջացնող մեթիլացման առաջին զեկույցն է (գործընթաց, որը պայմանավորված է փոքր վակուոլների կուտակմամբ, որոնք աստիճանաբար միաձուլվում են հսկա վակուոլների՝ ի վերջո հանգեցնելով թաղանթի պատռման և մահվան) սոճու ասեղների մեջ, որտեղ յոդինդոլը ցուցաբերում է զգալի նեմատիկական հատկություններ, որոնք նման են առևտրային նեմատիկին averm-ի հատկություններին:
Նախկինում հաղորդվել է, որ ինդոլներն իրականացնում են մի քանի ազդանշանային գործառույթներ պրոկարիոտների և էուկարիոտների մոտ, ներառյալ կենսաֆիլմի արգելակումը/ձևավորումը, բակտերիաների գոյատևումը և պաթոգենությունը19,32,33,34: Վերջերս հալոգենացված ինդոլների, ինդոլ ալկալոիդների և կիսասինթետիկ ինդոլ ածանցյալների պոտենցիալ թերապևտիկ ազդեցությունները մեծ հետազոտական ​​հետաքրքրություն են առաջացրել35,36,37: Օրինակ, ապացուցվել է, որ հալոգենացված ինդոլները սպանում են Escherichia coli-ի և Staphylococcus aureus-ի կայուն բջիջները37: Բացի այդ, գիտական ​​հետաքրքրություն է ներկայացնում հալոգենացված ինդոլների արդյունավետության ուսումնասիրությունը այլ տեսակների, սեռերի և թագավորությունների նկատմամբ, և այս ուսումնասիրությունը քայլ է դեպի այս նպատակին հասնելու համար:
Այստեղ մենք առաջարկում ենք C. elegans-ում 5-յոդոինդոլից առաջացած մահացության մեխանիզմ՝ հիմնված շրջելի բջջային վնասվածքի (RCI) և մեթիլացման վրա (Նկարներ 4C և 5): Այտուցային փոփոխությունները, ինչպիսիք են այտուցը և վակուոլային դեգեներացիան, RCI-ի և մեթիլացման ցուցանիշներ են, որոնք դրսևորվում են ցիտոպլազմում հսկա վակուոլների տեսքով48,49: RCI-ն խանգարում է էներգիայի արտադրությանը՝ նվազեցնելով ATP արտադրությունը, առաջացնելով ATPase պոմպի ձախողում կամ խաթարելով բջջային մեմբրանները և առաջացնելով Na+, Ca2+ և ջրի արագ ներհոսք50,51,52: Ներցիտոպլազմիկ վակուոլները առաջանում են կենդանական բջիջներում՝ Ca2+-ի և ջրի ներհոսքի պատճառով ցիտոպլազմայում հեղուկի կուտակման արդյունքում53։ Հետաքրքիր է, որ բջիջների վնասման այս մեխանիզմը շրջելի է, եթե վնասը ժամանակավոր է, և բջիջները սկսում են արտադրել ATP որոշակի ժամանակահատվածով, բայց եթե վնասը շարունակվում է կամ վատանում, բջիջները մեռնում են:
B. xylophilus-ում 5-յոդոինդոլով առաջացած մեթիլացման ֆենոտիպը կարող է պայմանավորված լինել յոդի առկայությամբ և դրա մոլեկուլային բաշխմամբ, քանի որ 7-յոդոինդոլն ավելի քիչ արգելակող ազդեցություն է ունեցել B. xylophilus-ի վրա, քան 5-յոդոինդոլը (Աղյուսակ 1 և լրացուցիչ նկար S6): Այս արդյունքները մասամբ համապատասխանում են Մալթայի և այլոց ուսումնասիրություններին: (2014), ով զեկուցել է, որ պիրիդիլ ազոտի մասի տեղափոխումը ինդոլում պարա- դիրքից դեպի մետա դիրք վերացրել է վակուոլացումը, աճի արգելակումը և ցիտոտոքսիկությունը U251 բջիջներում՝ ենթադրելով, որ մոլեկուլի փոխազդեցությունը սպիտակուցի հատուկ ակտիվ վայրի հետ կարևոր է27,44,4: Այս ուսումնասիրության մեջ նկատված ինդոլ կամ հալոգենացված ինդոլների և GluCL ընկալիչների փոխազդեցությունները նույնպես հաստատում են այս հասկացությունը, քանի որ պարզվել է, որ 5- և 2-յոդոինդոլը կապվում է GluCL ընկալիչների հետ ավելի ուժեղ, քան հետազոտված մյուս ինդոլները (Նկար 6 և լրացուցիչ նկար S8): Պարզվել է, որ ինդոլի երկրորդ կամ հինգերորդ դիրքում գտնվող յոդը կապվում է GluCL ընկալիչի լեյցին 218-ի հետ ողնաշարի ջրածնային կապերի միջոցով, մինչդեռ մյուս հալոգենացված ինդոլները և ինքը ինդոլը ստեղծում են թույլ կողային շղթայի ջրածնային կապեր սերին 260-ի հետ (Նկար 6): Հետևաբար, մենք ենթադրում ենք, որ հալոգենի տեղայնացումը կարևոր դեր է խաղում վակուոլային դեգեներացիայի առաջացման գործում, մինչդեռ 5-յոդոինդոլի ամուր կապը բաց է պահում իոնային ալիքը, դրանով իսկ թույլ տալով հեղուկի արագ ներհոսք և վակուոլի պատռում: Այնուամենայնիվ, 5-յոդոինդոլի գործողության մանրամասն մեխանիզմը դեռ պետք է որոշվի:
Նախքան 5-յոդոինդոլի գործնական կիրառումը, պետք է վերլուծել դրա թունավոր ազդեցությունը բույսերի վրա: Սերմերի բողբոջման մեր փորձերը ցույց տվեցին, որ 5-յոդոինդոլը ոչ մի բացասական ազդեցություն չի ունեցել սերմերի բողբոջման կամ հետագա զարգացման գործընթացների վրա ուսումնասիրված կոնցենտրացիաներում (Նկար 7): Այսպիսով, այս ուսումնասիրությունը հիմք է տալիս էկոլոգիական միջավայրում 5-յոդոինդոլի օգտագործման համար սոճու նեմատոդների վնասակարությունը սոճու ծառերի համար վերահսկելու համար:
Նախորդ զեկույցները ցույց են տվել, որ ինդոլի վրա հիմնված թերապիան հակաբիոտիկների դիմադրության և քաղցկեղի առաջընթացի խնդրի լուծման պոտենցիալ մոտեցում է55: Բացի այդ, ինդոլներն օժտված են հակաբակտերիալ, հակաքաղցկեղային, հակաօքսիդանտ, հակաբորբոքային, հակադիաբետիկ, հակավիրուսային, հակապրոլիֆերատիվ և հակատուբերկուլյոզային գործողություններով և կարող են խոստումնալից հիմք հանդիսանալ դեղերի զարգացման համար56,57: Այս ուսումնասիրությունն առաջին անգամ առաջարկում է յոդի պոտենցիալ օգտագործումը որպես հակամակաբույծ և հակահելմինտիկ միջոց:
Avermectin-ը հայտնաբերվել է երեք տասնամյակ առաջ և արժանացել Նոբելյան մրցանակի 2015 թվականին, և դրա օգտագործումը որպես հակահելմինթիկ դեռևս ակտիվորեն շարունակվում է: Այնուամենայնիվ, նեմատոդների և միջատների վնասատուների մոտ ավերմեկտինների նկատմամբ դիմադրողականության արագ զարգացման շնորհիվ անհրաժեշտ է այլընտրանքային, էժան և էկոլոգիապես մաքուր ռազմավարություն՝ վերահսկելու PWN վարակը սոճու ծառերում: Այս ուսումնասիրությունը նաև հայտնում է այն մեխանիզմը, որով 5-յոդոինդոլը սպանում է սոճու նեմատոդներին, և որ 5-յոդոինդոլը ցածր թունավորություն ունի բույսերի բջիջների համար, ինչը լավ հեռանկարներ է բացում դրա հետագա առևտրային կիրառման համար:
Բոլոր փորձերը հավանության են արժանացել Կորեայի Գյոնգնամի համալսարանի Էթիկայի հանձնաժողովի կողմից, և մեթոդներն իրականացվել են Եունգնամի համալսարանի էթիկայի հանձնաժողովի ուղեցույցներին համապատասխան:
Ձվի ինկուբացիոն փորձերը կատարվել են սահմանված ընթացակարգերի կիրառմամբ43: Հատման արագությունը (HR) գնահատելու համար 1 օրական չափահաս նեմատոդները (մոտ 100 էգ և 100 արու) տեղափոխվեցին սունկ պարունակող Պետրի ափսեներ և թույլ տվեցին աճել 24 ժամ: Այնուհետև ձվերը մեկուսացվել և մշակվել են 5-յոդոինդոլով (0,05 մՄ և 0,1 մՄ) կամ ավերմեկտինով (10 մկգ/մլ), որպես կասեցում ստերիլ թորած ջրի մեջ: Այս կախոցները (500 մկլ; մոտավորապես 100 ձու) տեղափոխվեցին 24 հորատանցք ունեցող հյուսվածքային կուլտուրայի ափսեի հորեր և ինկուբացվեցին 22 °C-ում: L2-ի հաշվարկները կատարվել են ինկուբացիայից 24 ժամ հետո, սակայն համարվում են մահացած, եթե բջիջները չեն շարժվում, երբ գրգռվում են նուրբ պլատինե մետաղալարով: Այս փորձն անցկացվել է երկու փուլով, յուրաքանչյուրը վեց կրկնությամբ։ Երկու փորձերի տվյալները համակցվեցին և ներկայացվեցին: HR-ի տոկոսը հաշվարկվում է հետևյալ կերպ.
Թրթուրների մահացությունը գնահատվել է՝ օգտագործելով նախկինում մշակված ընթացակարգերը: Նեմատոդների ձվերը հավաքվել են, և սաղմերը սինխրոնիզացվել են ստերիլ թորած ջրի մեջ դուրս գալու միջոցով՝ L2 փուլի թրթուրներ առաջացնելու համար: Սինքրոնացված թրթուրները (մոտ 500 նեմատոդ) մշակվել են 5-յոդոինդոլով (0,05 մՄ և 0,1 մՄ) կամ ավերմեկտինով (10 մկգ/մլ) և աճեցվել B. cinerea Petri թիթեղների վրա: 22 °C-ում 48 ժամ ինկուբացիայից հետո նեմատոդները հավաքվել են ստերիլ թորած ջրի մեջ և հետազոտվել L2, L3 և L4 փուլերի առկայության համար: L3 և L4 փուլերի առկայությունը ցույց է տալիս թրթուրների փոխակերպումը, մինչդեռ L2 փուլի առկայությունը ցույց է տալիս ոչ մի տրանսֆորմացիա: Պատկերները ձեռք են բերվել iRiS™ թվային բջջային պատկերման համակարգի միջոցով: Այս փորձն անցկացվել է երկու փուլով, յուրաքանչյուրը վեց կրկնությամբ։ Երկու փորձերի տվյալները համակցվեցին և ներկայացվեցին:
5-յոդոինդոլի և ավերմեկտինի թունավորությունը սերմերի համար գնահատվել է բողբոջման թեստերի միջոցով Murashige և Skoog ագարի սալերի վրա: 62 B. oleracea և R. raphanistrum սերմերը նախ թրջվել են ստերիլ թորած ջրի մեջ մեկ օրով, լվանալ 1 մլ 100% ստերիլ 5% էթանոլով (առևտրային 5% էթանոլով): նատրիումի հիպոքլորիտ) 15 րոպե, և հինգ անգամ լվացվեց 1 մլ ստերիլ ջրով: Այնուհետև ստերիլիզացված սերմերը սեղմվեցին բողբոջող ագարի թիթեղների վրա, որոնք պարունակում էին 0,86 գ/լ (0,2X) Murashige և Skoog միջավայր և 0,7% մանրէաբանական ագար՝ 5-յոդոինդոլով կամ ավերմեկտինով կամ առանց դրա: Այնուհետև թիթեղները ինկուբացվել են 22 °C ջերմաստիճանում, և նկարները վերցվել են 3 օր ինկուբացիայից հետո: Այս փորձն անցկացվել է երկու փուլով, որոնցից յուրաքանչյուրն ունեցել է վեց կրկնություն։