Ուրսա մոնոամիդների հայտնաբերում, բնութագրում և ֆունկցիոնալ բարելավում, որպես բույսերի աճի նոր արգելակիչներ, որոնք ազդում են բույսերի միկրոխողովակների վրա:

Շնորհակալություն Nature.com այցելելու համար:Ձեր օգտագործած բրաուզերի տարբերակը ունի սահմանափակ CSS աջակցություն:Լավագույն արդյունքների համար խորհուրդ ենք տալիս օգտագործել ձեր բրաուզերի ավելի նոր տարբերակը (կամ անջատել Համատեղելիության ռեժիմը Internet Explorer-ում):Միևնույն ժամանակ, շարունակական աջակցություն ապահովելու համար մենք կայքը ցուցադրում ենք առանց ոճավորման կամ JavaScript-ի:
Բնական արտադրանքի հայտնաբերումն ու շահավետ օգտագործումը կարող են օգնել բարելավել մարդու կյանքը:Բույսերի աճը արգելակող քիմիական նյութերը լայնորեն օգտագործվում են որպես թունաքիմիկատներ մոլախոտերի դեմ պայքարելու համար:Տարբեր տեսակի թունաքիմիկատների կիրառման անհրաժեշտությունից ելնելով անհրաժեշտություն է առաջանում բացահայտելու նոր մեխանիզմներով միացությունները:Այս ուսումնասիրության ընթացքում մենք հայտնաբերեցինք նոր N-ալկօքսիպիրոլ միացություն՝ կումամոնամիդ, Streptomyces werraensis MK493-CF1-ից և հաստատեցինք սինթեզի ամբողջական գործընթացը:Կենսաբանական ակտիվության վերլուծությունների միջոցով մենք հայտնաբերեցինք, որ urs-մոնոամիկ թթուն urs-monoamide-ի սինթետիկ միջանկյալ նյութ է և պոտենցիալբույսերի աճի արգելակիչ.Բացի այդ, մենք մշակել ենք ուրբենոնաթթվի տարբեր ածանցյալներ, ներառյալ urbenyloxy ածանցյալը (UDA), որն ունի բարձր հերբիցիդային ակտիվություն՝ բացասաբար չազդելով HeLa բջիջների աճի վրա:Մենք նաև պարզեցինք, որ ուրմոտոնիկ թթվի ածանցյալները խաթարում են բույսերի միկրոխողովակները.Բացի այդ, KAND-ը ազդում է ակտինի թելերի վրա և հրահրում բջիջների մահը.Այս բազմակողմ էֆեկտները տարբերվում են հայտնի միկրոխողովակային ինհիբիտորներից և առաջարկում են ուրսոնաթթվի գործողության նոր մեխանիզմ, որը կարևոր առավելություն է նոր թունաքիմիկատների ստեղծման գործում:
Օգտակար բնական արտադրանքի և դրանց ածանցյալների հայտնաբերումն ու գործնական կիրառումը մարդու կյանքի որակի բարելավման միջոց է:Միկրոօրգանիզմների, բույսերի և միջատների կողմից արտադրված երկրորդային մետաբոլիտները հանգեցրել են բժշկության և գյուղատնտեսության մեծ առաջընթացի:Բնական արտադրանքներից ստեղծվել են բազմաթիվ հակաբիոտիկներ և հակալեյկոզային դեղամիջոցներ:Բացի այդ, տարբեր տեսակներթունաքիմիկատներ, ֆունգիցիդներն ու թունաքիմիկատները արդյունահանվում են այս բնական արտադրանքներից՝ գյուղատնտեսության մեջ օգտագործելու համար։Մասնավորապես, մոլախոտերի դեմ պայքարի թունաքիմիկատները ժամանակակից գյուղատնտեսության մեջ մշակաբույսերի բերքատվության բարձրացման կարևոր գործիքներ են, և տարբեր տեսակի միացություններ արդեն օգտագործվում են առևտրային ոլորտում:Բույսերի մի քանի բջջային գործընթացներ, ինչպիսիք են ֆոտոսինթեզը, ամինաթթուների նյութափոխանակությունը, բջջային պատի սինթեզը, միտոզի կարգավորումը, ֆիտոհորմոնների ազդանշանը կամ սպիտակուցի սինթեզը, համարվում են թունաքիմիկատների բնորոշ թիրախներ:Միացությունները, որոնք արգելակում են միկրոխողովակների գործառույթը, հերբիցիդների ընդհանուր դաս են, որոնք ազդում են բույսերի աճի վրա՝ ազդելով միտոտիկ կարգավորման վրա2:
Միկրոխողովակները ցիտոկմախքի բաղադրիչներն են և լայնորեն պահպանված են էուկարիոտ բջիջներում:Տուբուլինի հետերոդիմերը բաղկացած է α-տուբուլինից և β-տուբուլինից, որոնք ձևավորում են գծային միկրոխողովակային նախաթելեր՝ 13 նախաթելերով, որոնք կազմում են գլանաձև կառուցվածք։Միկրոխողովակները բազմաթիվ դերեր են խաղում բույսերի բջիջներում, ներառյալ բջիջների ձևի որոշումը, բջիջների բաժանումը և ներբջջային տրանսպորտը3,4:Բուսական բջիջները պարունակում են միկրոխողովակներ միջֆազային պլազմային թաղանթի տակ, և ենթադրվում է, որ այս, այսպես կոչված, կեղևային միկրոխողովակները վերահսկում են բջջանյութի միկրոֆիբրիլների կազմակերպումը ցելյուլոզային սինթազային համալիրների կարգավորման միջոցով4,5:Արմատային էպիդերմիսի բջիջների կեղևային միկրոխողովակները, որոնք առկա են արմատի ծայրի արագ երկարացման գոտում, գտնվում են կողային, իսկ ցելյուլոզային միկրոթելերը հետևում են այդ միկրոխողովակներին և սահմանափակում բջիջների ընդլայնման ուղղությունը՝ դրանով իսկ նպաստելով բջիջների անիզոտրոպ երկարացմանը:Հետեւաբար, միկրոխողովակների գործառույթը սերտորեն կապված է բույսերի մորֆոլոգիայի հետ:Ամինաթթուների փոխարինումները տուբուլին կոդավորող գեներում առաջացնում են կեղևային միկրոխողովակային զանգվածների շեղում և ձախ կամ աջակողմյան աճ Արաբիդոպսիս 6,7-ում:Նմանապես, միկրոխողովակների հետ կապված սպիտակուցների մուտացիաները, որոնք կարգավորում են միկրոխողովակների դինամիկան, կարող են նաև հանգեցնել արմատների խեղաթյուրման8,9,10,11,12,13:Բացի այդ, միկրոխողովակները խանգարող թունաքիմիկատներով բուժումը, ինչպիսին է դիսոպիրամիդը, որը նաև հայտնի է որպես պրետիլաքլոր, նույնպես առաջացնում է ձախակողմյան թեք արմատների աճ14:Այս տվյալները ցույց են տալիս, որ միկրոխողովակների ֆունկցիայի ճշգրիտ կարգավորումը կարևոր է բույսերի աճի ուղղությունը որոշելու համար:
Հայտնաբերվել են միկրոխողովակների ինհիբիտորների տարբեր տեսակներ, և այդ դեղամիջոցները զգալի ներդրում են ունեցել ցիտոկմախքի հետազոտության, ինչպես նաև գյուղատնտեսության և բժշկության մեջ2:Մասնավորապես, օրիզալինը, դինիտրոանիլինի միացությունները, դիզոպիրամիդը, բենզամիդի հետ կապված միացությունները և դրանց անալոգները կարող են արգելակել միկրոխողովակների գործառույթը և դրանով իսկ արգելակել բույսերի աճը:Հետեւաբար, դրանք լայնորեն օգտագործվում են որպես թունաքիմիկատներ:Այնուամենայնիվ, քանի որ միկրոխողովակները բույսերի և կենդանական բջիջների կարևոր բաղադրիչն են, միկրոխողովակային ինհիբիտորների մեծ մասը ցիտոտոքսիկ են բջիջների երկու տեսակների համար:Հետևաբար, չնայած որպես թունաքիմիկատների ճանաչված օգտակարությանը, գործնական նպատակներով օգտագործվում են սահմանափակ քանակությամբ հակամանրէային խողովակներ:
Streptomyces-ը Streptomyces ընտանիքի ցեղ է, որը ներառում է աերոբ, գրամ դրական, թելիկ մանրէներ և լայնորեն հայտնի է երկրորդական մետաբոլիտների լայն տեսականի արտադրելու իր ունակությամբ:Ուստի այն համարվում է նոր կենսաբանական ակտիվ բնական արտադրանքի ամենակարևոր աղբյուրներից մեկը։Ընթացիկ ուսումնասիրության ընթացքում մենք հայտնաբերեցինք մի նոր միացություն, որը կոչվում է կումամոնամիդ, որը մեկուսացված էր Streptomyces werraensis MK493-CF1-ից և S. werraensis ISP 5486-ից: Օգտագործելով սպեկտրային վերլուծություն և ամբողջական սպեկտրալ վերլուծություն, բնութագրվեց կումամոնամիդի կառուցվածքը և նրա եզակի N-alkoxypyrrole կմախքը: որոշվել է.սինթեզ.Պարզվել է, որ ուրսմոնաթթուն՝ ուրսմոնոամիդի և նրա ածանցյալների սինթետիկ միջանկյալ նյութը, արգելակում է հայտնի մոդելի՝ Arabidopsis thaliana բույսի աճն ու բողբոջումը:Կառուցվածք-ակտիվություն փոխհարաբերությունների ուսումնասիրության ժամանակ մենք պարզեցինք, որ C9-ով միացությունը, որը ձևափոխվել է ուրսոնաթթվի, կոչվում է ուրսոնաթթվի նոնիլոքսի ածանցյալ (KAND), զգալիորեն ուժեղացնում է աճի և բողբոջման վրա արգելակող ազդեցությունը:Հատկանշական է, որ նորահայտ բույսերի աճի արգելակիչն ազդել է նաև ծխախոտի և լյարդի աճի վրա և ցիտոտոքսիկ չի եղել բակտերիաների կամ HeLa բջիջների համար:Ավելին, ուրմոտոնիկ թթվի որոշ ածանցյալներ առաջացնում են արմատի խեղաթյուրված ֆենոտիպ, ինչը ենթադրում է, որ այդ ածանցյալները ուղղակիորեն կամ անուղղակիորեն ազդում են միկրոխողովակների վրա:Այս գաղափարին համահունչ՝ իմունոհիստոքիմիական կամ լյումինեսցենտ սպիտակուցներով պիտակավորված միկրոխողովակների մեր դիտարկումները ցույց են տալիս, որ KAND բուժումը ապապոլիմերացնում է միկրոխողովակները:Բացի այդ, կումամոտոնիկ թթվի ածանցյալներով բուժումը խաթարել է ակտինի միկրոթելերը:Այսպիսով, մենք հայտնաբերել ենք բույսերի աճի նոր արգելակիչ, որի գործողության յուրահատուկ մեխանիզմը ներառում է ցիտոկմախքի ոչնչացումը:
MK493-CF1 շտամը մեկուսացվել է Տոկիոյի Շինագավա-կու հողից:MK493-CF1 շտամը ձևավորել է լավ ճյուղավորված ստրոմալ միցելիում:Որոշվել է 16S ռիբոսոմային ՌՆԹ գենի մասնակի հաջորդականությունը (1422 bp):Այս շտամը շատ նման է S. werraensis-ին (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T. բնորոշ շտամ, 99,93%):Այս արդյունքի հիման վրա պարզվեց, որ այս շտամը սերտորեն կապված է S. werraensis տեսակի շտամի հետ:Հետևաբար, մենք այս շտամը ժամանակավորապես անվանեցինք S. werraensis MK493-CF1:S. werraensis ISP 5486T-ը նույնպես արտադրում է նույն կենսաակտիվ միացությունները:Քանի որ այս միկրոօրգանիզմից բնական արտադրանք ստանալու վերաբերյալ վաղ հետազոտությունները քիչ են եղել, հետագա քիմիական հետազոտություններ են իրականացվել:S. werraensis MK493-CF1-ը գարու միջավայրի վրա 14 օր շարունակ 30°C-ում պինդ վիճակում խմորումով մշակելուց հետո, միջավայրը արդյունահանվել է 50% EtOH-ով:60 մլ նմուշը չորացրել են՝ ստանալու համար 59,5 մգ չմշակված էքստրակտ:Հում էքստրակտը ենթարկվել է հակադարձ փուլային HPLC-ի՝ ստանալու N-մեթօքսի-1H-պիրոլ-2-կարբոքսամիդ (1, անվանված կումամոնամիդ, 36,0 մգ):1-ի ընդհանուր քանակը կազմում է հումքի արդյունահանման մոտավորապես 60%-ը:Ուստի մենք որոշեցինք մանրամասն ուսումնասիրել կումամոտոամիդ 1-ի հատկությունները։
Coumamonamide 1-ը սպիտակ ամորֆ փոշի է և բարձր լուծաչափով զանգվածային սպեկտրոմետրիան (HRESIMS) հաստատում է C6H8N2O2 (նկ. 1):Այս միացության C2-փոխարինված պիրոլի բեկորը բնութագրվում է δH 6.94 (1H, t, J = 2.8, 4.8 Հց, H-4), δH 6.78 (1H, d, J = 2.5, δH 1H NMR սպեկտրում՝ 4.5 Հց): , H-5) և δH 6.78 (1H, d, J = 2.5 Հց, H-6), իսկ 13C NMR սպեկտրը ցույց է տալիս չորս sp2 ածխածնի ատոմների առկայությունը:Ամիդային խմբի առկայությունը C2 դիրքում գնահատվել է HMBC հարաբերակցությամբ C-3 պրոտոնից դեպի ամիդ կարբոնիլ ածխածինը δC 161.1-ում:Բացի այդ, 1 H և 13 C NMR գագաթները δH 4.10 (3H, S) և δC 68.3-ում ցույց են տալիս N-մեթոքսի խմբերի առկայությունը մոլեկուլում:Թեև մեթոքսի խմբի ճիշտ դիրքը դեռևս չէր որոշվել՝ օգտագործելով սպեկտրոսկոպիկ անալիզ, ինչպիսիք են ուժեղացված տարբերությունների սպեկտրոսկոպիան և միջուկային Overhauser հապավումը (NOEDF), N-մեթոքսի-1H-պիրոլ-2-կարբոքսամիդը դարձավ առաջին թեկնածու միացությունը:
1-ի ճիշտ կառուցվածքը որոշելու համար կատարվել է տոտալ սինթեզ (նկ. 2ա):Առևտրային հասանելի 2-ամինոպիրիդին 2-ի մշակումը m-CPBA-ով հանգեցրեց համապատասխան N-օքսիդ 3-ի քանակական ելքի:2-ի 2-ամինոազիդացումից հետո Աբրամովիչի նկարագրած ցիկլոկոնդենսացման ռեակցիան իրականացվել է բենզոլում 90°C ջերմաստիճանում՝ ստանալով ցանկալի 1-հիդրօքսի-1H-պիրոլ-2-կարբոնիտրիլ 5 գրամը:Արագություն 60% (երկու փուլ):15,16.4-ի մեթիլացումը և հիդրոլիզը այնուհետև տվեցին 1-մեթօքսի-1H-պիրոլ-2-կարբոքսիլաթթու (կոչվում է «կումոտոնիկ թթու», 6) լավ ելքով (70%, երկու քայլ):Վերջապես, ամիդացումը թթվային քլորիդ միջանկյալ 6-ի միջոցով ջրային ամոնիակի միջոցով տվեց Կումամոտո ամիդ 1 98% ելքով:Սինթեզված 1-ի բոլոր սպեկտրային տվյալները նման էին մեկուսացված 1-ին, ուստի որոշվեց 1-ի կառուցվածքը.
Ուրբենամիդի և ուրբենաթթվի կենսագործունեության ընդհանուր սինթեզ և վերլուծություն:ա) Կումամոտո ամիդի ընդհանուր սինթեզը.(բ) Յոթ օրական վայրի տիպի Arabidopsis Columbia (Col) սածիլները աճեցվել են Murashige և Skoog (MS) թիթեղների վրա, որոնք պարունակում են coumamonamide 6 կամ coumamonamide 1 նշված կոնցենտրացիաներով:Կշեռքի բար = 1 սմ:
Նախ, մենք գնահատեցինք ուրբենամիդի և նրա միջանկյալ նյութերի կենսաբանական գործունեությունը բույսերի աճը կարգավորելու ունակության համար:Մենք ավելացրեցինք ուրսմոնամիդ 1-ի կամ ուրսմոնաթթվի 6-ի տարբեր կոնցենտրացիաներ MS ագարի միջավայրին և այս միջավայրի վրա աճեցրեցինք Arabidopsis thaliana սածիլները:Այս փորձարկումները ցույց են տվել, որ 6-ի բարձր կոնցենտրացիաները (500 մկՄ) արգելակում են արմատների աճը (նկ. 2բ):Այնուհետև մենք ստեղծեցինք տարբեր ածանցյալներ՝ փոխարինելով 6-ի N1 դիրքը և կատարեցինք կառուցվածք-ակտիվություն փոխհարաբերությունների ուսումնասիրություններ (անալոգային սինթեզի գործընթացը նկարագրված է Աջակցող տեղեկատվության մեջ (SI)):Արաբիդոպսիսի սածիլները աճեցվել են 50 մկմ ուրսոնաթթվի ածանցյալներ պարունակող միջավայրի վրա, և չափվել է արմատի երկարությունը:ինչպես ցույց է տրված նկարում։Ինչպես ցույց է տրված 3a, b և S1 նկարներում, կումամո թթուներն ունեն տարբեր երկարությունների գծային ալկօքսի շղթաներ (9, 10, 11, 12 և 13) կամ մեծ ալկոքսի շղթաներ (15, 16 և 17) N1 դիրքում:Ածանցյալները ցույց են տվել արմատների աճի զգալի արգելակում:Բացի այդ, մենք պարզեցինք, որ 200 μM 10, 11 կամ 17 կիրառումը արգելակում է բողբոջումը (նկ. 3c և S2):
Կումամոտո ամիդի և հարակից միացությունների կառուցվածք-ակտիվություն փոխհարաբերությունների ուսումնասիրություն:ա) Անալոգների կառուցվածքի և սինթեզի սխեման.բ) MS միջավայրում աճեցված 7 օրական սածիլների արմատի երկարության քանակական որոշում 50 մկմ կումամոնամիդային ածանցյալներով կամ առանց դրա:Աստղանիշները ցույց են տալիս զգալի տարբերություններ կեղծ բուժման հետ (t թեստ, էջ< 0,05):n>18. Տվյալները ցուցադրվում են որպես միջին ± SD:nt նշանակում է «չփորձարկված», քանի որ սերմերի ավելի քան 50%-ը չի բողբոջել:գ) 7 օր MS միջավայրում ինկուբացված մշակված սերմերի բողբոջման արագության քանակական գնահատում 200 μM կումամոնամիդով և հարակից միացություններով կամ առանց դրա:Աստղանիշները ցույց են տալիս զգալի տարբերություններ կեղծ բուժման հետ (chi-square թեստ):n=96.
Հետաքրքիր է, որ C9-ից երկար ալկիլային կողային շղթաների ավելացումը նվազեցրեց արգելակող ակտիվությունը՝ ենթադրելով, որ կումամոտաթթվի հետ կապված միացությունները պահանջում են որոշակի չափի կողային շղթաներ՝ իրենց կենսաբանական ակտիվությունը ցուցադրելու համար:
Քանի որ կառուցվածք-ակտիվություն փոխհարաբերությունների վերլուծությունը ցույց է տվել, որ C9-ը ձևափոխվել է ուրսոնաթթվի, իսկ ուրսոնաթթվի նոնիլոքսի ածանցյալը (այսուհետ՝ KAND 11) բույսերի աճի ամենաարդյունավետ արգելակիչն է, մենք իրականացրել ենք KAND 11-ի ավելի մանրամասն բնութագրում: Արաբիդոպսիսի բուժումը: 50 μM KAND 11-ով գրեթե ամբողջությամբ կանխել են բողբոջումը, մինչդեռ KAND 11-ի ավելի ցածր կոնցենտրացիաները (40, 30, 20 կամ 10 մկՄ) արգելակել են արմատների աճը դոզայից կախված եղանակով (նկ. 4ա, բ):Փորձելու համար, թե արդյոք KAND 11-ն ազդում է արմատային մերիստեմի կենսունակության վրա, մենք ուսումնասիրեցինք պրոպիդիումի յոդիդով ներկված արմատային մերիստեմները և չափեցինք մերիստեմի տարածքի չափը:25 μM KAND-11 պարունակող միջավայրում աճեցված տնկիների մերիստեմի չափը 151,1 ± 32,5 մկմ էր, մինչդեռ DMSO պարունակող հսկիչ միջավայրի վրա աճեցված տնկիների չափը 264,7 ± 30,8 մկմ էր (նկ. 4c, d) , ինչը ցույց է տալիս, որ KAND-11-ը վերականգնում է բջջային ակտիվությունը:տարածելով.Արմատային մերիստեմ:Դրան համահունչ՝ KAND 11 բուժումը նվազեցրեց բջիջների բաժանման մարկեր CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS ազդանշանի քանակը արմատային մերիստեմում (նկ. 4e) 17:Այս արդյունքները ցույց են տալիս, որ KAND 11-ը արգելակում է արմատների աճը՝ նվազեցնելով բջիջների բազմացման ակտիվությունը:
Ուրբենոնաթթվի ածանցյալների (ուրբենիլօքսի ածանցյալներ) աճի վրա արգելակող ազդեցության վերլուծություն:ա) 7 օրական վայրի տիպի Col սածիլներ աճեցված MS ափսեների վրա KAND 11 նշված կոնցենտրացիաներով: Կշեռքի բար = 1 սմ:բ) Արմատների երկարության քանակականացում:Նամակները ցույց են տալիս զգալի տարբերություններ (Tukey HSD թեստ, էջ< 0,05):n>16. Տվյալները ցուցադրվում են որպես միջին ± SD:գ) պրոպիդիումի յոդիդով ներկված վայրի տիպի Col արմատների կոնֆոկալ մանրադիտակ՝ աճեցված MS թիթեղների վրա 25 մկՄ KAND 11. Սպիտակ փակագծերը ցույց են տալիս արմատային մերիստեմը:Սանդղակի սանդղակը = 100 մկմ:դ) Արմատային մերիստեմի չափի քանակական հաշվարկ (n = 10-ից 11):Վիճակագրական տարբերությունները որոշվել են t-test-ի միջոցով (էջ< 0,05):Ձողերը ներկայացնում են մերիստեմի միջին չափը:ե) CDKB2 կոնստրուկցիա պարունակող արմատային մերիստամի դիֆերենցիալ ինտերֆերենցիոն կոնտրաստի (DIC) մանրադիտակ.1pro: CDKB2;1-GUS ներկված և ներկված 5 օրական սածիլների վրա, որոնք աճեցվել են MS սալերի վրա 25 մկՄ KAND վերլուծությամբ կամ առանց դրա:
KAND 11-ի ֆիտոտոքսիկությունը հետագայում փորձարկվել է մեկ այլ երկշաքիլավոր բույսի՝ ծխախոտի (Nicotiana tabacum) և հիմնական ցամաքային բույսերի մոդելային օրգանիզմի՝ լյարդի (Marchantia polymorpha) օգտագործմամբ:Ինչպես Արաբիդոպսիսի դեպքում, ծխախոտի SR-1 սածիլները, որոնք աճեցվել են 25 մկՄ KAND 11 պարունակող միջավայրի վրա, ավելի կարճ արմատներ են տվել (նկ. 5ա):Բացի այդ, 48 սերմերից 40-ը բողբոջել են 200 μM KAND 11 պարունակող թիթեղների վրա, մինչդեռ բոլոր 48 սերմերը բողբոջել են կեղծ մշակված միջավայրում, ինչը ցույց է տալիս, որ KAND-ի ավելի բարձր կոնցենտրացիաները նշանակալի են (p.< 0,05;chi test-square) արգելակել է ծխախոտի բողբոջումը:(նկ. 5բ):Բացի այդ, KAND 11-ի կոնցենտրացիան, որն արգելակում էր բակտերիաների աճը լյարդի մեջ, նման էր Արաբիդոպսիսի արդյունավետ կոնցենտրացիային (նկ. 5c):Այս արդյունքները ցույց են տալիս, որ KAND 11-ը կարող է արգելակել մի շարք բույսերի աճը:Այնուհետև մենք ուսումնասիրեցինք արջի մոնոամիդի հետ կապված միացությունների հնարավոր ցիտոտոքսիկությունը այլ օրգանիզմներում, մասնավորապես՝ մարդու HeLa բջիջներում և Escherichia coli շտամում DH5α, որպես համապատասխանաբար ավելի բարձր կենդանական և բակտերիալ բջիջների ներկայացուցիչներ:Բջիջների տարածման մի շարք փորձարկումների ժամանակ մենք նկատեցինք, որ կումամոնամիդ 1-ը, կումամոնամիդային թթուն 6-ը և KAND 11-ը չեն ազդել HeLa-ի կամ E. coli-ի բջիջների աճի վրա 100 μM կոնցենտրացիաներում (նկ. 5d,e):
KAND 11-ի աճի արգելակումը ոչ արաբիդոպսիս օրգանիզմներում:ա) Վայրի SR-1 ծխախոտի երկշաբաթյա սածիլները աճեցվել են ուղղահայաց դիրքավորված MS սալերի վրա, որոնք պարունակում են 25 μM KAND 11: բ) Երկու շաբաթական վայրի տիպի SR-1 ծխախոտի սածիլները աճեցվել են հորիզոնական դիրքով MS թիթեղներ, որոնք պարունակում են 200 μM KAND 11. (գ) Վայրի տիպի Tak-1 լյարդի երկշաբաթյա բողբոջներ՝ աճեցված Gamborg B5 թիթեղների վրա՝ KAND 11 նշված կոնցենտրացիաներով: Կարմիր սլաքները ցույց են տալիս սպորները, որոնք դադարել են աճել երկշաբաթյա ինկուբացիայի ընթացքում: ժամանակաշրջան։դ) HeLa բջիջների բջիջների տարածման վերլուծություն:Կենսունակ բջիջների թիվը չափվել է ֆիքսված ժամանակային ընդմիջումներով՝ օգտագործելով բջիջների հաշվման հավաքածու 8 (Dojindo):Որպես հսկողություն՝ HeLa բջիջները մշակվել են 5 մկգ/մլ ակտինոմիցին D-ով (Act D), որն արգելակում է ՌՆԹ պոլիմերազի տրանսկրիպցիան և առաջացնում բջիջների մահ։Վերլուծությունները կատարվել են եռակի:(ե) E. coli բջիջների տարածման վերլուծություն.E. coli-ի աճը վերլուծվել է OD600 չափման միջոցով:Որպես հսկող միջոց՝ բջիջները մշակվել են 50 μg/ml ամպիցիլինի (Amp), որը արգելակում է բակտերիալ բջջային պատի սինթեզը:Վերլուծությունները կատարվել են եռակի:
Ուրամիդի հետ կապված միացությունների կողմից առաջացած ցիտոտոքսիկության գործողության մեխանիզմը վերծանելու համար մենք վերավերլուծեցինք ուրբենաթթվի ածանցյալները՝ չափավոր արգելակիչ ազդեցությամբ:ինչպես ցույց է տրված նկարում։Ինչպես ցույց է տրված Նկար 2b, 6a-ում, ուրմոտոնիկ թթու 6-ի բարձր կոնցենտրացիաներով (200 մկՄ) պարունակող ագարի թիթեղների վրա աճեցված սածիլները առաջացրել են ավելի կարճ և ձախ կոր արմատներ (θ = – 23.7 ± 6.1), մինչդեռ հսկիչ միջավայրում աճեցված սածիլները. սածիլները տվել են գրեթե ուղիղ արմատներ (θ = – 3,8 ± 7,1):Այս բնորոշ թեք աճը, ինչպես հայտնի է, առաջանում է կեղևային միկրոխողովակների դիսֆունկցիայի հետևանքով14,18:Այս բացահայտման համաձայն՝ միկրոխողովակները ապակայունացնող դեղամիջոցները դիսոպիրամիդը և օրիզալինը առաջացրել են արմատների նմանատիպ թեքություն մեր աճի պայմաններում (Նկար 2b, 6a):Միևնույն ժամանակ, մենք փորձարկեցինք ուրմոտոնիկ թթվի ածանցյալները և ընտրեցինք դրանցից մի քանիսը, որոնք որոշակի կոնցենտրացիաների դեպքում առաջացնում էին արմատների թեք աճ:8, 9 և 15 միացությունները փոխել են արմատների աճի ուղղությունը համապատասխանաբար 75 մկՄ, 50 մկՄ և 40 մկՄ՝ ցույց տալով, որ այս միացությունները կարող են արդյունավետորեն ապակայունացնել միկրոխողովակները (նկ. 2b, 6a):Մենք նաև փորձարկեցինք ուրսոլաթթվի ամենաուժեղ ածանցյալը՝ KAND 11-ը, ավելի ցածր կոնցենտրացիայով (15 մկՄ) և պարզեցինք, որ KAND 11-ի կիրառումը արգելակում է արմատների աճը, և որ արմատների աճի ուղղությունը անհավասար է, թեև դրանք հակված են թեքվելու դեպի ձախ ( Գծապատկեր C3):.Քանի որ միկրոխողովակները ապակայունացնող դեղամիջոցների ավելի բարձր կոնցենտրացիաները երբեմն արգելակում են բույսերի աճը, այլ ոչ թե առաջացնում արմատների թեքություն, մենք հետագայում գնահատեցինք այն հնարավորությունը, որ KAND 11-ը ազդում է միկրոխողովակների վրա՝ դիտարկելով արմատային էպիդերմիսի բջիջներում կեղևային միկրոխողովակները:Իմունոհիստոքիմիան, օգտագործելով հակա-β-տուբուլինային հակամարմինները, սածիլների արմատների էպիդերմիկ բջիջներում, որոնք մշակվել են 25 մկՄ KAND 11-ով, ցույց է տվել երկարացման գոտում էպիդերմիսի բջիջների գրեթե բոլոր կեղևային միկրոխողովակների անհետացումը (նկ. 6b):Այս արդյունքները ցույց են տալիս, որ կումամոտոնիկ թթուն և նրա ածանցյալները ուղղակիորեն կամ անուղղակիորեն գործում են միկրոխողովակների վրա՝ խաթարելով դրանք, և որ այդ միացությունները նոր միկրոխողովակային արգելակիչներ են:
Ուրսոնիկ թթուն և նրա ածանցյալները փոխում են կեղևային միկրոխողովակները Arabidopsis thaliana-ում:ա) Արմատի թեքության անկյունը, որը չափվում է ուրմոտոնիկ թթվի տարբեր ածանցյալների առկայության դեպքում նշված կոնցենտրացիաներում:Վերլուծվել են նաև միկրոխողովակներն արգելակող երկու միացությունների՝ դիսոպիրամիդի և օրիզալինի ազդեցությունը:Ներդիրը ցույց է տալիս ստանդարտը, որն օգտագործվում է արմատների աճի անկյունը չափելու համար:Աստղանիշները ցույց են տալիս զգալի տարբերություններ կեղծ բուժման հետ (t թեստ, էջ< 0,05):n>19. Կշեռքի բար = 1 սմ:բ) Կեղևային միկրոխողովակներ էպիդերմիսի բջիջներում երկարացման գոտում:Վայրի տիպի Arabidopsis Col արմատների միկրոխողովակները, որոնք աճեցվել են MS թիթեղների վրա՝ 25 մկՄ KAND 11-ով կամ առանց դրա, տեսանելի են իմունոհիստոքիմիական ներկման միջոցով՝ օգտագործելով β-տուբուլինի առաջնային հակամարմինները և Alexa Fluor-ով կոնյուգացված երկրորդական հակամարմինները:Սանդղակի սանդղակը = 10 մկմ:գ) Արմատային մերիստեմում միկրոխողովակների միտոտիկ կառուցվածքը:Միկրոխողովակները վիզուալացվել են իմունոհիստոքիմիական ներկման միջոցով:Միտոտիկ կառուցվածքները, ներառյալ պրոֆազային գոտիները, սպինդլերը և ֆրագմոպլաստները, հաշվվել են համաֆոկալ պատկերներից:Սլաքները ցույց են տալիս միտոտիկ միկրոխողովակային կառուցվածքները:Աստղանիշները ցույց են տալիս զգալի տարբերություններ կեղծ բուժման հետ (t թեստ, էջ< 0,05):n>9. Կշեռքի սանդղակը = 50 մկմ:
Չնայած Ursa-ն ունի միկրոխողովակների գործառույթը խաթարելու հատկություն, ակնկալվում է, որ դրա գործողության մեխանիզմը տարբերվում է միկրոխողովակների ապապոլիմերացման տիպիկ նյութերից:Օրինակ, միկրոխողովակները ապապոլիմերացնող նյութերի ավելի բարձր կոնցենտրացիաները, ինչպիսիք են դիսոպիրամիդը և օրիզալինը, հրահրում են էպիդերմիսի բջիջների անիզոտրոպ ընդլայնումը, մինչդեռ KAND 11-ը՝ ոչ:Ի լրումն, KAND 11-ի և disopyramide-ի համատեղ կիրառումը հանգեցրեց արմատների աճի համակցված դիսոպիրամիդի կողմից առաջացած արձագանքի և նկատվեց KAND 11-ի կողմից առաջացած աճի արգելակում (նկ. S4):Մենք նաև վերլուծել ենք գերզգայուն դիսոպիրամիդ 1-1 (phs1-1) մուտանտի արձագանքը KAND 11-ին: phs1-1-ն ունի ոչ կանոնական տուբուլինկինազային կետային մուտացիա և առաջացնում է ավելի կարճ արմատներ, երբ մշակվում է դիսոպիրամիդով9,20:phs1-1 մուտանտի սածիլները, որոնք աճեցվել են KAND 11 պարունակող ագարի միջավայրի վրա, ավելի կարճ արմատներ ունեին, որոնք նման էին դիզոպիրամիդի վրա աճեցվածներին (նկ. S5):
Բացի այդ, մենք նկատեցինք միտոտիկ միկրոխողովակային կառուցվածքներ, ինչպիսիք են պրոֆազային գոտիները, սպինդլները և ֆրագմոպլաստները, KAND 11-ով մշակված տնկիների արմատային մերիստեմում: նկատվել է միտոտիկ միկրոխողովակների քանակը (նկ. .6c):
KAND 11-ի ցիտոտոքսիկությունը ենթաբջջային լուծաչափում բնութագրելու համար մենք մշակեցինք ծխախոտի BY-2 կախովի բջիջները KAND 11-ով և դիտարկեցինք դրանց արձագանքը:Մենք նախ ավելացրինք KAND 11-ը BY-2 բջիջներին, որոնք արտահայտում են TagRFP-TUA6, որը լյումինեսցենտով պիտակավորում է միկրոխողովակները՝ գնահատելու համար KAND 11-ի ազդեցությունը կեղևային միկրոխողովակների վրա:Կեղևի միկրոխողովակների խտությունը գնահատվել է պատկերի վերլուծության միջոցով, որը քանակականացրել է ցիտոկմախքի պիքսելների տոկոսը ցիտոպլազմային պիքսելների միջև:Փորձարկման արդյունքները ցույց են տվել, որ 1 ժամվա ընթացքում 50 μM կամ 100 μM KAND 11-ով բուժումից հետո խտությունը զգալիորեն նվազել է մինչև 0,94 ± 0,74% կամ 0,23 ± 0,28%, համապատասխանաբար, մինչդեռ DMSO-ով մշակված բջիջների խտությունը կազմել է ± 0,634: % (նկ. 7ա):Այս արդյունքները համապատասխանում են Arabidopsis-ի այն դիտարկմանը, որ KAND 11 բուժումը հրահրում է կեղևային միկրոխողովակների ապապոլիմերացում (նկ. 6b):Մենք նաև ուսումնասիրեցինք BY-2 գիծը GFP-ABD պիտակավորված ակտինի թելերով KAND 11-ի նույն կոնցենտրացիայով բուժումից հետո և նկատեցինք, որ KAND 11 բուժումը խաթարում է ակտինի թելերը:50 μM կամ 100 μM KAND 11-ով բուժումը 1 ժամվա ընթացքում զգալիորեն նվազեցրեց ակտինի թելի խտությունը մինչև 1,20 ± 0,62% կամ 0,61 ± 0,26%, համապատասխանաբար, մինչդեռ DMSO-ով մշակված բջիջներում խտությունը 1,69 ± 0,52% էր (նկ. 0,51%):7 բ).Այս արդյունքները հակադրվում են պրոպիզամիդի էֆեկտներին, որը չի ազդում ակտինի թելերի վրա, և լատրունկուլին B-ի՝ ակտինի դեպոլիմերիզատորի, որը չի ազդում միկրոխողովակների վրա ( SI Նկար S6):Բացի այդ, կումամոնամիդ 1, կումամոնամիդ թթու 6 կամ KAND 11 բուժումը չի ազդել HeLa բջիջների միկրոխողովակների վրա (SI Նկար S7):Այսպիսով, ենթադրվում է, որ KAND 11-ի գործողության մեխանիզմը տարբերվում է ցիտոկմախքի հայտնի խանգարողներից:Բացի այդ, KAND 11-ով մշակված BY-2 բջիջների մեր մանրադիտակային դիտարկումը բացահայտեց բջիջների մահվան սկիզբը KAND 11 բուժման ընթացքում և ցույց տվեց, որ Էվանսի կապույտ ներկված մահացած բջիջների մասնաբաժինը զգալիորեն չի աճել KAND 11 բուժման 30 րոպեից հետո, մինչդեռ. 50 μM կամ 100 μM KAND-ով 90 րոպե բուժումից հետո մահացած բջիջների թիվը համապատասխանաբար աճել է մինչև 43,7% կամ 80,1% (նկ. 7c):Այս տվյալները միասին վերցրած ցույց են տալիս, որ ուրսոլաթթվի նոր ածանցյալ KAND 11-ը բույսերին հատուկ ցիտոկմախքի արգելակիչ է՝ գործողության նախկինում անհայտ մեխանիզմով:
KAND-ը ազդում է կեղևային միկրոխողովակների, ակտինի թելերի և ծխախոտի BY-2 բջիջների կենսունակության վրա:ա) Կեղևային միկրոխողովակների պատկերացում BY-2 բջիջներում TagRFP-TUA6-ի առկայության դեպքում:BY-2 բջիջները, որոնք մշակվել են KAND 11 (50 μM կամ 100 μM) կամ DMSO-ով, հետազոտվել են կոնֆոկալ մանրադիտակով:Կեղևի միկրոխողովակների խտությունը հաշվարկվել է 25 անկախ բջիջների միկրոգրաֆիաներից:Նամակները ցույց են տալիս զգալի տարբերություններ (Tukey HSD թեստ, էջ< 0,05):Սանդղակի սանդղակը = 10 մկմ:(բ) Կեղևի ակտինի թելերը BY-2 բջիջներում, որոնք տեսանելի են GFP-ABD2-ի առկայության դեպքում:BY-2 բջիջները, որոնք մշակվել են KAND 11 (50 μM կամ 100 μM) կամ DMSO-ով, հետազոտվել են կոնֆոկալ մանրադիտակով:Կեղևային ակտինի թելերի խտությունը հաշվարկվել է 25 անկախ բջիջների միկրոգրաֆիաներից:Նամակները ցույց են տալիս զգալի տարբերություններ (Tukey HSD թեստ, էջ< 0,05):Սանդղակի սանդղակը = 10 մկմ:(գ) Մահացած BY-2 բջիջների դիտարկումը Էվանսի կապույտ գունավորմամբ:BY-2 բջիջները, որոնք մշակվել են KAND 11-ով (50 մկՄ կամ 100 մկՄ) կամ DMSO-ով, հետազոտվել են լուսավոր դաշտային մանրադիտակով:n=3.Սանդղակի սանդղակը = 100 մկմ:
Նոր բնական արտադրանքի հայտնաբերումն ու կիրառումը հանգեցրել են զգալի առաջընթացի մարդկային կյանքի տարբեր ասպեկտներում, ներառյալ բժշկությունը և գյուղատնտեսությունը:Պատմական հետազոտություններ են կատարվել բնական պաշարներից օգտակար միացություններ ստանալու համար։Մասնավորապես, հայտնի է, որ ակտինոմիցետները օգտակար են որպես հակամակաբույծ հակաբիոտիկներ նեմատոդների համար, քանի որ դրանք կարող են արտադրել տարբեր երկրորդական մետաբոլիտներ, ինչպիսիք են ավերմեկտինը, իվերմեկտինի և բլեոմիցինի կապարային միացությունը և դրա ածանցյալները, որոնք օգտագործվում են բժշկության մեջ որպես հակաքաղցկեղային նյութ21,22:Նմանապես, ակտինոմիցետներից հայտնաբերվել են մի շարք հերբիցիդային միացություններ, որոնցից մի քանիսն արդեն օգտագործվում են առևտրային ոլորտում1,23:Հետևաբար, ակտինոմիցետների մետաբոլիտների վերլուծությունը ցանկալի կենսաբանական ակտիվությամբ բնական արտադրանքը մեկուսացնելու համար համարվում է արդյունավետ ռազմավարություն:Այս ուսումնասիրության ընթացքում մենք հայտնաբերեցինք նոր միացություն՝ կումամոնամիդ, S. werraensis-ից և հաջողությամբ սինթեզեցինք այն:Ուրսոնիկ թթուն ուրբենամիդի և նրա ածանցյալների սինթետիկ միջանկյալ նյութն է:Այն կարող է առաջացնել արմատների բնորոշ գանգրացում, դրսևորել չափավոր և ուժեղ հերբիցիդային ակտիվություն և ուղղակիորեն կամ անուղղակիորեն վնասել բույսերի միկրոխողովակները:Այնուամենայնիվ, ուրմոտոնիկ թթվի գործողության մեխանիզմը կարող է տարբերվել գոյություն ունեցող միկրոխողովակային ինհիբիտորներից, քանի որ KAND 11-ը նաև խաթարում է ակտինի թելերը և առաջացնում բջիջների մահ՝ առաջարկելով կարգավորող մեխանիզմ, որով ուրմոտոնիկ թթուն և նրա ածանցյալները ազդում են ցիտոկմախքի կառուցվածքների լայն շրջանակի վրա:.
Ուրբենոնաթթվի հետագա մանրամասն բնութագրումը կօգնի ավելի լավ հասկանալ ուրբենոնաթթվի գործողության մեխանիզմը:Մասնավորապես, հաջորդ նպատակն է գնահատել ուրսոնաթթվի կարողությունը՝ միանալու կրճատված միկրոխողովակներին՝ որոշելու համար, թե արդյոք ուրսոնաթթուն և նրա ածանցյալները ուղղակիորեն գործում են միկրոխողովակների վրա և ապապոլիմերացնում դրանք, թե արդյոք դրանց գործողությունը հանգեցնում է միկրոխողովակների ապակայունացմանը:Բացի այդ, այն դեպքում, երբ միկրոխողովակները ուղղակի թիրախ չեն, բույսերի բջիջների վրա ուրսոնաթթվի գործողության վայրի և մոլեկուլային թիրախների հայտնաբերումը կօգնի հետագայում հասկանալ հարակից միացությունների հատկությունները և հերբիցիդային ակտիվությունը բարելավելու հնարավոր ուղիները:Մեր կենսաակտիվության վերլուծությունը բացահայտեց ուրսոնիկ թթվի եզակի ցիտոտոքսիկ կարողությունը այնպիսի բույսերի աճի վրա, ինչպիսիք են Arabidopsis thaliana-ն, ծխախոտը և լյարդը, մինչդեռ ոչ E. coli-ն, ոչ էլ HeLa բջիջները չեն տուժել:Կենդանական բջիջների համար չնչին կամ ոչ թունավոր լինելը ուրսոնաթթվի ածանցյալների առավելությունն է, եթե դրանք մշակվում են որպես թունաքիմիկատներ՝ բաց գյուղատնտեսական դաշտերում օգտագործելու համար:Իրոք, քանի որ միկրոխողովակները էուկարիոտների ընդհանուր կառուցվածքն են, բույսերում դրանց ընտրովի արգելակումը հերբիցիդների հիմնական պահանջն է:Օրինակ, պրոպիզամիդը՝ միկրոխողովակները ապապոլիմերացնող նյութ, որն ուղղակիորեն միանում է տուբուլինին և արգելակում պոլիմերացումը, օգտագործվում է որպես թունաքիմիկատ՝ կենդանական բջիջների համար ցածր թունավորության պատճառով24:Ի տարբերություն դիսոպիրամիդի, հարակից բենզամիդներն ունեն տարբեր թիրախային առանձնահատկություններ:Բացի բույսերի միկրոխողովակներից, RH-4032-ը կամ բենզոքսամիդը նաև արգելակում են համապատասխանաբար կենդանական բջիջների կամ օոմիցետների միկրոխողովակները, իսկ զալիլամիդը որպես ֆունգիցիդ օգտագործվում է ցածր ֆիտոտոքսիկության պատճառով25,26,27:Նոր հայտնաբերված արջը և նրա ածանցյալները բույսերի նկատմամբ ընտրովի ցիտոտոքսիկություն են ցուցաբերում, սակայն հարկ է նշել, որ հետագա փոփոխությունները կարող են փոխել դրանց թիրախային առանձնահատկությունները՝ պոտենցիալ լրացուցիչ ածանցյալներ ապահովելով պաթոգեն սնկերի կամ օոմիցետների վերահսկման համար:
Ուրբենոնաթթվի և նրա ածանցյալների եզակի հատկությունները օգտակար են դրանց մշակման համար որպես թունաքիմիկատներ և օգտագործել որպես հետազոտական ​​գործիքներ:Բջջային կմախքի կարևորությունը բույսերի բջիջների ձևը վերահսկելու գործում լայնորեն ճանաչված է:Ավելի վաղ ուսումնասիրությունները ցույց են տվել, որ բույսերը զարգացրել են կեղևային միկրոխողովակների կազմակերպման բարդ մեխանիզմներ՝ վերահսկելով միկրոխողովակների դինամիկան՝ մորֆոգենեզը ճիշտ վերահսկելու համար:Հայտնաբերվել են մեծ թվով մոլեկուլներ, որոնք պատասխանատու են միկրոխողովակների գործունեության կարգավորման համար, և հարակից հետազոտությունները դեռ շարունակվում են3,4,28:Բուսական բջիջներում միկրոխողովակների դինամիկայի մեր ներկայիս պատկերացումները լիովին չեն բացատրում կեղևային միկրոխողովակների կազմակերպման մեխանիզմները:Օրինակ, թեև և՛ դիսոպիրամիդը, և՛ օրիզալինը կարող են ապապոլիմերացնել միկրոխողովակները, դիզոպիրամիդը առաջացնում է արմատների խիստ աղավաղում, մինչդեռ օրիզալինն ունի համեմատաբար մեղմ ազդեցություն:Ավելին, տուբուլինի մուտացիաները, որոնք կայունացնում են միկրոխողովակները, նույնպես առաջացնում են արմատների դեքստրոտացիա, մինչդեռ պակլիտաքսելը, որը նույնպես կայունացնում է միկրոխողովակների դինամիկան, չի առաջացնում:Հետևաբար, ուրսոլաթթվի մոլեկուլային թիրախների ուսումնասիրությունն ու բացահայտումը պետք է նոր պատկերացումներ տա բույսերի կեղևային միկրոխողովակների կարգավորման վերաբերյալ:Նմանապես, քիմիական նյութերի ապագա համեմատությունները, որոնք արդյունավետ են աղավաղված աճը խթանելու համար, ինչպես օրինակ դիսոպիրամիդը, և ավելի քիչ արդյունավետ քիմիական նյութերի, ինչպիսիք են օրիզալինը կամ կումամոտորիկ թթուն, թույլ կտան ցույց տալ, թե ինչպես է աղավաղված աճը տեղի ունենում:
Մյուս կողմից, պաշտպանության հետ կապված ցիտոկմախքի վերադասավորումները ևս մեկ հնարավորություն են բացատրելու ուրսոնաթթվի ցիտոտոքսիկությունը:Հարթածնի վարակումը կամ էլիկատորի ներմուծումը բույսերի բջիջներ երբեմն առաջացնում է ցիտոկմախքի ոչնչացում և հետագա բջիջների մահ29:Օրինակ, հաղորդվել է, որ օոմիցետից ստացված կրիպտոքսանտինը խաթարում է միկրոխողովակները և ակտինի թելերը մինչև ծխախոտի բջիջների մահը, ինչպես որ տեղի է ունենում KAND բուժման դեպքում30,31:Ուրսոնաթթվի կողմից առաջացած պաշտպանական և բջջային պատասխանների նմանությունները մեզ ստիպեցին ենթադրել, որ դրանք առաջացնում են ընդհանուր բջջային գործընթացներ, թեև ուրսոնաթթվի ավելի արագ և ուժեղ ազդեցությունն ակնհայտ է, քան կրիպտոքսանտինը:Այնուամենայնիվ, ուսումնասիրությունները ցույց են տվել, որ ակտինի թելերի խախտումը նպաստում է բջիջների ինքնաբուխ մահվանը, որը միշտ չէ, որ ուղեկցվում է միկրոխողովակների խզումով29:Բացի այդ, մնում է պարզել, թե արդյոք հարուցիչը կամ առաջացնողը առաջացնում են արմատների աղավաղված աճ, ինչպես դա անում են ուրսոնաթթվի ածանցյալները:Այսպիսով, պաշտպանական պատասխանները և ցիտոկմախքը կապող մոլեկուլային գիտելիքը գրավիչ խնդիր է, որը պետք է լուծվի:Օգտագործելով ուրսոնաթթվի հետ կապված ցածր մոլեկուլային քաշի միացությունների, ինչպես նաև տարբեր հզորություններով մի շարք ածանցյալների առկայությունը, նրանք կարող են հնարավորություններ ընձեռել թիրախավորելու անհայտ բջջային մեխանիզմները:
Միասին, նոր միացությունների հայտնաբերումն ու կիրառումը, որոնք կարգավորում են միկրոխողովակների դինամիկան, հզոր մեթոդներ կապահովեն բույսերի բջիջների ձևի որոշման հիմքում ընկած բարդ մոլեկուլային մեխանիզմները լուծելու համար:Այս համատեքստում, վերջերս մշակված ուրմոտոնիկ թթուն, որն ազդում է միկրոխողովակների և ակտինի թելերի վրա և հրահրում բջիջների մահը, կարող է հնարավորություն ընձեռել վերծանելու միկրոխողովակների կառավարման և այս այլ մեխանիզմների միջև կապը:Այսպիսով, քիմիական և կենսաբանական վերլուծությունը ուրբենոնաթթվի միջոցով կօգնի մեզ հասկանալ մոլեկուլային կարգավորիչ մեխանիզմները, որոնք վերահսկում են բույսերի ցիտոկմախքը:
S. werraensis MK493-CF1 պատվաստել 500 մլ շփոթված Էրլենմայերի կոլբայի մեջ, որը պարունակում է 110 մլ սերմերի միջավայր, որը բաղկացած է 2% (w/v) գալակտոզից, 2% (w/v) Essence paste, 1% (w/v) Bacto բաղադրությունից: .-սոյտոն (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0.5% (w/v) եգիպտացորենի էքստրակտ (KOGOSTCH Co., Ltd., Japan), 0.2% (w/v) (NH4)2SO4 և 0.2% CaCO3 դեիոնացված ջրում։(pH 7.4 նախքան ստերիլիզացումը):Սերմերի կուլտուրաները 2 օր ինկուբացվել են պտտվող թափահարողի վրա (180 պտ/րոպե) 27°C ջերմաստիճանում:Արտադրության մշակում պինդ վիճակում խմորման միջոցով:Սերմերի կուլտուրան (7 մլ) տեղափոխել են 500 մլ K-1 կոլբայի մեջ, որը պարունակում է 40 գ արտադրական միջավայր, որը բաղկացած է 15 գ սեղմված գարիից (MUSO Co., Ltd., Ճապոնիա) և 25 գ դեոնացված ջրից (pH չկարգավորված): ստերիլիզացումից առաջ):).Խմորումն իրականացվել է 30°C մթության մեջ 14 օր շարունակ։Ֆերմենտացման նյութը արդյունահանվել է 40 մլ/շիշ EtOH և ցենտրիֆուգվել (1500 գ, 4°C, 10 րոպե):Մշակույթի վերին նյութը (60 մլ) արդյունահանվել է 10% MeOH/EtOAc խառնուրդով:Օրգանական շերտը գոլորշիացվել է նվազեցված ճնշման տակ՝ մնացորդ ստանալու համար (59,5 մգ), որը ենթարկվել է HPLC-ի գրադիենտ լուծմամբ (0–10 րոպե՝ 90%) հակառակ փուլային սյունակի վրա (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 մկմ, ID։ 10 մմ × երկարություն 250 մմ) H2O/CH3CN, 10–35 րոպե՝ 90% H2O/CH3CN մինչև 70% H2O/CH3CN (գրադիենտ), 35–45 րոպե՝ 90% H2O/EtOH, 45–155 րոպե՝ 90% H2O։ /EtOH-ից մինչև 100% EtOH (գրադիենտ (գրադիենտ), 155–200 րոպե՝ 100% EtOH) 1,5 մլ/րոպե հոսքի արագությամբ, կումամոնամիդը (1, 36,0 մգ) մեկուսացվել է որպես սպիտակ ամորֆ փոշի։
Կումամոտամիդ (1);1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.93 (t, J = 2.5 Hz, 1H), 6.76 (dd, J = 4.3, 1.8 Hz 1H), 6.05 (t, J = 3.8 Hz, 1H):), 4.08 (s, 3H);13C-NMR (125 ՄՀց, CDCl3) δ 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3;ESI-HRMS [M+H]+.
Կոլումբիայի սերմերը (Col-0) ստացվել են Արաբիդոպսիս Կենսաբանական ռեսուրսների կենտրոնից (ABRC)՝ հետազոտական ​​օգտագործման թույլտվությամբ:Col-0 սերմերը բազմապատկվել և պահպանվել են մեր լաբորատոր պայմաններում և օգտագործվել որպես վայրի տիպի արաբիդոպսիս բույսեր:Արաբիդոպսիսի սերմերը մակերեսային մանրէազերծվել և մշակվել են կիսաուժեղ Murashige և Skoog միջավայրում, որը պարունակում է 2% սախարոզա (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0,05% (w/v) 2-(4-մորֆոլինո)էթանսուլֆոնաթթու (MES) (Fujifilm Wako Pure C): ).) և 1,5% ագար (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5,7, 23 °C ջերմաստիճանում և մշտական ​​լույսով։Phs1-1 մուտանտի սերմերը տրամադրվել են Տ. Հաշիմոտոյի կողմից (Նարա գիտության և տեխնիկայի ինստիտուտ):
SR-1 շտամի սերմերը տրամադրվել են Տ. Հաշիմոտոյի կողմից (Նարա գիտության և տեխնիկայի ինստիտուտ) և օգտագործվել որպես վայրի տիպի ծխախոտի բույսեր:Ծխախոտի սերմերը մակերեսային մանրէազերծվեցին և երեք գիշեր թրջվեցին ստերիլ ջրի մեջ՝ բողբոջումը խթանելու համար, այնուհետև տեղադրվեցին կիսաուժ լուծույթի մեջ, որը պարունակում է 2% սախարոզա, 0,05% (w/v) MES և 0,8% գելլան ռետին (Fujifilm Wako Pure Chemical) Մուրաշիգե.և Skoog միջավայր) pH 5.7 և ինկուբացված 23°C-ում մշտական ​​լույսի ներքո:
Strain Tak-1-ը տրամադրվել է T. Kohchi-ի կողմից (Կիոտոյի համալսարան) և օգտագործվել է որպես լյարդի քաղցկեղի հետազոտության ստանդարտ փորձարարական միավոր:Gemma-ն ստացվել է մանրէազերծված աճեցված բույսերից, այնուհետև 1% սախարոզա և 0.3% գելլան ռետին պարունակող Gamborg B5 միջավայրում (Fujifilm Wako Pure Chemical) թաղվել և ինկուբացվել 23°C-ում շարունակական լույսի ներքո:
Ծխախոտի BY-2 բջիջները (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) տրամադրվել են S. Hasezawa-ի կողմից (Տոկիոյի համալսարան):BY-2 բջիջները նոսրացվել են 95 անգամ մոդիֆիկացված Linsmeier և Skoog միջավայրում և շաբաթական լրացվել 2,4-դիքլորֆենօքսիաթթվով 32:Բջջային կախոցը խառնվել է պտտվող թափահարողի վրա 130 ռ/րոպե 27°C-ում մթության մեջ:Լվացեք բջիջները թարմ միջավայրի 10 անգամ ավելի ծավալով և նորից կասեցրեք նույն միջավայրում:BY-2 տրանսգենային բջջային գծեր, որոնք կայուն կերպով արտահայտում են միկրոխողովակային մարկեր TagRFP-TUA6 կամ ակտինի թելիկի մարկեր GFP-ABD2, ծաղկակաղամբի մոզաիկա վիրուսի 35S խթանիչի տակ, ստեղծվել են ինչպես նկարագրված է33,34,35:Այս բջջային գծերը կարող են պահպանվել և սինխրոնիզացվել՝ օգտագործելով ընթացակարգերը, որոնք նման են սկզբնական BY-2 բջջային գծի համար օգտագործվող ընթացակարգերին:
HeLa բջիջները մշակվել են Dulbecco-ի մոդիֆիկացված Eagle's միջավայրում (DMEM) (Life Technologies)՝ լրացված 10% պտղի եղջերավոր շիճուկով, 1.2 U/ml պենիցիլինով և 1.2 μg/ml streptomycin-ով 37°C ինկուբատորում՝ 5% CO2:
Այս ձեռագրում նկարագրված բոլոր փորձերը կատարվել են կենսաանվտանգության ճապոնական կանոնակարգերի և ուղեցույցների համաձայն:
Միացությունները լուծվել են դիմեթիլ սուլֆօքսիդի մեջ (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) որպես պահեստային լուծույթներ և նոսրացվել են MS միջավայրում Արաբիդոպսիսի և ծխախոտի կամ Gamborg B5 միջավայրում՝ լյարդի համար:Արմատների աճի արգելակման հետազոտության համար մեկ ափսեի մեջ ավելի քան 10 սերմ է ցանվել նշված միացությունները կամ DMSO պարունակող ագարի միջավայրի վրա:Սերմերը ինկուբացվել են աճի խցիկում 7 օր:Սածիլները լուսանկարել են, չափել արմատների երկարությունը։Արաբիդոպսիսի բողբոջման հետազոտության համար յուրաքանչյուր ափսեի մեջ 48 սերմ է ցանվել 200 մկմ միացություն կամ DMSO պարունակող ագարի միջավայրի վրա:Արաբիդոպսիսի սերմերը աճեցվել են աճի խցիկում և բողբոջած տնկիների թիվը հաշվվել է բողբոջումից 7 օր հետո (դագ):Ծխախոտի բողբոջման վերլուծության համար մեկ ափսեի մեջ 24 սերմ է ցանվել 200 μM KAND կամ DMSO պարունակող ագարի միջավայրի վրա:Ծխախոտի սերմերը աճեցվել են աճեցման խցիկում և 14 օր հետո հաշվվել են բողբոջած տնկիների թիվը:Լյարդի աճի արգելակման հետազոտության համար յուրաքանչյուր թիթեղից 9 սաղմ դրվել է ագարի միջավայրի վրա, որը պարունակում է KAND կամ DMSO նշված կոնցենտրացիաները և ինկուբացվել աճի պալատում 14 օր:
Օգտագործեք սածիլներ, որոնք ներկված են 5 մգ/մլ պրոպիդիումի յոդիդով (PI)՝ արմատային մերիստեմի կազմակերպումը պատկերացնելու համար:PI ազդանշանները դիտվել են ֆլյուորեսցենտային մանրադիտակի միջոցով՝ օգտագործելով TCS SPE կոնֆոկալ լազերային սկանավորման մանրադիտակ (Leica Microsystems):
Արմատների հիստոքիմիական ներկումը β-գլյուկուրոնիդազով (GUS) կատարվել է Malami-ի և Benfey-ի կողմից նկարագրված արձանագրության համաձայն:Սածիլները գիշերվա ընթացքում ամրացրել են 90% ացետոնի մեջ, ներկել 0,5 մգ/մլ 5-բրոմ-4-քլոր-3-ինդոլիլ-β-d-գլյուկուրոնաթթվով GUS բուֆերում 1 ժամով և տեղադրել հիդրատացված քլորալդեհիդի լուծույթում:(8 գ քլորալի հիդրատ, 2 մլ ջուր և 1 մլ գլիցերին) և դիտարկվել դիֆերենցիալ միջամտության հակադրություն մանրադիտակով Axio Imager M1 մանրադիտակի միջոցով (Carl Zeiss):
Արմատային անկյունները չափվել են ուղղահայաց տեղադրված թիթեղների վրա աճեցված 7 օրական տնկիների վրա:Չափել արմատի անկյունը ձգողականության վեկտորի ուղղությամբ, ինչպես նկարագրված է 6-րդ քայլում:
Կեղևային միկրոխողովակների դասավորությունը դիտվել է այնպես, ինչպես նկարագրված է, արձանագրության չնչին փոփոխություններով 37:Հակաբ-տուբուլինային հակամարմինները (KMX-1, Merk Millipore. MAB3408) և Alexa Fluor 488-ի կոնյուգացված հակամկնիկի IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) օգտագործվել են որպես առաջնային և երկրորդային հակամարմիններ 1:1000 և 1:100 նոսրացումներով, համապատասխանաբար.Լյումինեսցենտային պատկերները ստացվել են TCS SPE կոնֆոկալ լազերային սկանավորման մանրադիտակի միջոցով (Leica Microsystems):Ձեռք բերեք Z-stack պատկերներ և ստեղծեք առավելագույն ինտենսիվության կանխատեսումներ՝ ըստ արտադրողի հրահանգների:
HeLa բջիջների տարածման փորձարկումն իրականացվել է Բջջային հաշվառման հավաքածու 8 (Dojindo) օգտագործմամբ՝ ըստ արտադրողի ցուցումների:
E. coli DH5α-ի աճը վերլուծվել է մշակույթում բջիջների խտությունը չափելով սպեկտրոֆոտոմետրի միջոցով 600 նմ (OD600):
Բջջային կմախքի կազմակերպումը տրանսգենային BY-2 բջիջներում դիտարկվել է ֆլյուորեսցենտային մանրադիտակի միջոցով, որը հագեցած է CSU-X1 կոնֆոկալ սկանավորման սարքով (Yokogawa) և sCMOS տեսախցիկով (Zyla, Andor Technology):Բջջային կմախքի խտությունը գնահատվել է պատկերի վերլուծության միջոցով, որը քանակականացրել է ցիտոպլազմային պիքսելների տոկոսը ցիտոպլազմային պիքսելների միջև համաֆոկալ պատկերներում՝ օգտագործելով ImageJ ծրագրակազմը, ինչպես նկարագրված է38,39:
Բջջային մահը BY-2 բջիջներում հայտնաբերելու համար բջիջների կախույթի մասնաբաժինը ինկուբացվել է 0,05% Էվանսի կապույտով 10 րոպե սենյակային ջերմաստիճանում:Մահացած բջիջների ընտրովի Էվանսի կապույտ ներկումը կախված է անձեռնմխելի պլազմային մեմբրանի միջոցով կենսունակ բջիջներից ներկանյութի արտամղումից40:Ներկված բջիջները դիտարկվել են պայծառ դաշտային մանրադիտակի միջոցով (BX53, Olympus):
HeLa բջիջները աճեցվել են DMEM-ում, որը լրացվել է 10% FBS-ով խոնավացված ինկուբատորում 37°C ջերմաստիճանում և 5% CO2:Բջիջները մշակվել են 100 μM KAND 11, կումամոնամիկ թթու 6, կումամոնամիդ 1, 100 նգ/մլ կոլսեմիդ (Gibco) կամ 100 նգ/մլ Nocodmaze (Sigma) 6 ժամ 37°C ջերմաստիճանում:Բջիջները ֆիքսվել են MetOH-ով 10 րոպե, ապա ացետատով 5 րոպե սենյակային ջերմաստիճանում:Ֆիքսված բջիջները ինկուբացվել են β-տուբուլինի առաջնային հակամարմինով (1D4A4, Proteintech: 66240-1) նոսրացված 0,5% BSA/PBS-ով 2 ժամ, լվացվել 3 անգամ TBST-ով, այնուհետև ինկուբացվել են Alexa Fluor այծի հակամարմինով:488 1 ժամ.– Մկնիկի IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) և 15 նգ/մլ 4′,6-դիամիդինո-2-ֆենիլինդոլ (DAPI) նոսրացված 0,5% BSA/PBS-ում:TBST-ով երեք անգամ լվանալուց հետո ներկված բջիջները դիտվել են Nikon Eclipse Ti-E շրջված մանրադիտակի վրա:Պատկերները նկարահանվել են սառեցված Hamamatsu ORCA-R2 CCD տեսախցիկով՝ օգտագործելով MetaMorph ծրագրաշարը (Molecular Devices):