Արջի մոնոամիդների հայտնաբերումը, բնութագրումը և ֆունկցիոնալ բարելավումը որպես բույսերի միկրոխողովակների վրա ազդող նոր բույսերի աճի արգելակիչներ։

Շնորհակալություն Nature.com կայք այցելելու համար: Ձեր օգտագործած դիտարկիչի տարբերակն ունի CSS-ի սահմանափակ աջակցություն: Լավագույն արդյունքի հասնելու համար խորհուրդ ենք տալիս օգտագործել ձեր դիտարկիչի ավելի նոր տարբերակը (կամ անջատել համատեղելիության ռեժիմը Internet Explorer-ում): Մինչ այդ, շարունակական աջակցությունն ապահովելու համար, մենք կայքը ցուցադրում ենք առանց ոճավորման կամ JavaScript-ի:
Բնական արտադրանքի հայտնաբերումը և օգտակար օգտագործումը կարող են նպաստել մարդկային կյանքի բարելավմանը: Բույսերի աճը արգելակող քիմիական նյութերը լայնորեն օգտագործվում են որպես մոլախոտերի դեմ պայքարի համար նախատեսված մոլախոտերի դեմ պայքարի մոլախոտերի դեմ պայքարի մոլախոտերի դեմ պայքարի միջոցներ: Տարբեր տեսակի մոլախոտերի դեմ պայքարի անհրաժեշտության պատճառով անհրաժեշտություն կա բացահայտել գործողության նոր մեխանիզմներով միացություններ: Այս ուսումնասիրության ընթացքում մենք Streptomyces werraensis MK493-CF1-ից հայտնաբերեցինք նոր N-ալկօքսիպիրոլային միացություն՝ կումամոնամիդ, և հաստատեցինք ամբողջական սինթեզի գործընթացը: Կենսաբանական ակտիվության փորձարկումների միջոցով մենք պարզեցինք, որ ուրս-մոնոամինաթթուն ուրս-մոնոամիդի սինթետիկ միջանկյալ է և պոտենցիալ...բույսերի աճի արգելակիչԲացի այդ, մենք մշակել ենք տարբեր ուրբենոնաթթվի ածանցյալներ, այդ թվում՝ ուրբենիլօքսի ածանցյալը (UDA), որն ունի բարձր մոլախոտերի դեմ պայքարի ակտիվություն՝ առանց բացասաբար ազդելու HeLa բջիջների աճի վրա: Մենք նաև պարզել ենք, որ ուրմոտոնաթթվի ածանցյալները խաթարում են բույսերի միկրոխողովակները. բացի այդ, KAND-ը ազդում է ակտինի թելիկների վրա և առաջացնում է բջիջների մահ: Այս բազմակողմանի ազդեցությունները տարբերվում են հայտնի միկրոխողովակային ինհիբիտորներից և ենթադրում են ուրսոնաթթվի գործողության նոր մեխանիզմ, որը կարևոր առավելություն է ներկայացնում նոր մոլախոտերի դեմ պայքարի միջոցների մշակման գործում:
Օգտակար բնական արտադրանքի և դրանց ածանցյալների հայտնաբերումը և գործնական կիրառումը մարդկային կյանքի որակը բարելավելու միջոց է: Միկրոօրգանիզմների, բույսերի և միջատների կողմից արտադրվող երկրորդային մետաբոլիտները հանգեցրել են բժշկության և գյուղատնտեսության մեջ մեծ առաջընթացի: Բնական արտադրանքներից մշակվել են բազմաթիվ հակաբիոտիկներ և հակալեյկոզային դեղամիջոցներ: Բացի այդ, տարբեր տեսակի...թունաքիմիկատներ, այս բնական արտադրանքներից գյուղատնտեսությունում օգտագործելու համար արդյունահանվում են ֆունգիցիդներ և մոլախոտերի դեմ պայքարի մոլախոտերի դեմ պայքարի միջոցները կարևոր գործիքներ են ժամանակակից գյուղատնտեսությունում բերքի բերքատվությունը բարձրացնելու համար, և տարբեր տեսակի միացություններ արդեն օգտագործվում են առևտրային նպատակներով: Բույսերի մի շարք բջջային գործընթացներ, ինչպիսիք են ֆոտոսինթեզը, ամինաթթուների նյութափոխանակությունը, բջջային պատի սինթեզը, միտոզի կարգավորումը, ֆիտոհորմոնների ազդանշանային փոխանցումը կամ սպիտակուցների սինթեզը, համարվում են մոլախոտերի դեմ պայքարի միջոցների բնորոշ թիրախներ: Միկրոխողովակների ֆունկցիան արգելակող միացությունները մոլախոտերի դեմ պայքարի միջոցների տարածված դաս են, որոնք ազդում են բույսերի աճի վրա՝ ազդելով միտոտիկ կարգավորման վրա2:
Միկրոխողովակները ցիտոկմախքի բաղադրիչներ են և լայնորեն պահպանված են էուկարիոտ բջիջներում: Տուբուլինի հետերոդիմերը բաղկացած է α-տուբուլինից և β-տուբուլինից, որոնք կազմում են գծային միկրոխողովակների նախաթելամենտներ, որոնցից 13-ը կազմում են գլանաձև կառուցվածք: Միկրոխողովակները բազմաթիվ դերեր են խաղում բույսերի բջիջներում, այդ թվում՝ որոշելով բջջի ձևը, բջջային բաժանումը և ներբջջային տեղափոխությունը3,4: Բույսերի բջիջները պարունակում են միկրոխողովակներ միջֆազային պլազմային թաղանթի տակ, և այս այսպես կոչված կեղևային միկրոխողովակները, ենթադրվում է, որ կարգավորում են ցելյուլոզային միկրոֆիբրիլների կազմակերպումը՝ ցելյուլոզային սինթազի համալիրների կարգավորման միջոցով4,5: Արմատային էպիդերմալ բջիջների կեղևային միկրոխողովակները, որոնք գտնվում են արմատի ծայրի արագ երկարացման գոտում, տեղակայված են կողմնային, և ցելյուլոզային միկրոմանրաթելերը հետևում են այդ միկրոխողովակներին և սահմանափակում բջիջների ընդարձակման ուղղությունը, դրանով իսկ խթանելով անիզոտրոպ բջիջների երկարացումը: Հետևաբար, միկրոխողովակների ֆունկցիան սերտորեն կապված է բույսերի ձևաբանության հետ: Տուբուլինը կոդավորող գեներում ամինաթթուների փոխարինումները Arabidopsis-ում առաջացնում են կեղևային միկրոխողովակների զանգվածների շեղում և ձախ կամ աջ կողմի աճ 6,7: Նմանապես, միկրոխողովակների դինամիկան կարգավորող միկրոխողովակների հետ կապված սպիտակուցների մուտացիաները նույնպես կարող են հանգեցնել արմատների աղավաղված աճի8,9,10,11,12,13: Բացի այդ, միկրոխողովակները խաթարող մոլախոտերի դեմ պայքարի միջոցներով, ինչպիսին է դիսոպիրամիդը, որը հայտնի է նաև որպես պրետիլաքլոր, մշակումը նույնպես առաջացնում է ձախ կողմի թեք արմատային աճ14: Այս տվյալները ցույց են տալիս, որ միկրոխողովակների ֆունկցիայի ճշգրիտ կարգավորումը կարևոր է բույսերի աճի ուղղությունը որոշելու համար:
Հայտնաբերվել են միկրոխողովակների ինհիբիտորների տարբեր տեսակներ, և այս դեղամիջոցները նշանակալի ներդրում են ունեցել ցիտոկմախքի հետազոտություններում, ինչպես նաև գյուղատնտեսության և բժշկության մեջ2: Մասնավորապես, օրիզալինը, դինիտրոանիլինի միացությունները, դիսոպիրամիդը, բենզամիդին առնչվող միացությունները և դրանց անալոգները կարող են արգելակել միկրոխողովակների ֆունկցիան և դրանով իսկ խոչընդոտել բույսերի աճը: Հետևաբար, դրանք լայնորեն օգտագործվում են որպես մոլախոտերի դեմ պայքարի միջոցներ: Այնուամենայնիվ, քանի որ միկրոխողովակները բույսերի և կենդանիների բջիջների կարևոր բաղադրիչ են, միկրոխողովակների ինհիբիտորների մեծ մասը ցիտոտոքսիկ են երկու բջջային տեսակների համար էլ: Հետևաբար, չնայած որպես մոլախոտերի դեմ պայքարի միջոցներ ճանաչված օգտակարությանը, գործնական նպատակներով օգտագործվում են հակամիկրոխողովակային միջոցների սահմանափակ քանակ:
Streptomyces-ը Streptomyces ընտանիքի ցեղ է, որը ներառում է աէրոբ, գրամ-դրական, թելանման մանրէներ և լայնորեն հայտնի է երկրորդային մետաբոլիտների լայն տեսականի արտադրելու իր ունակությամբ: Հետևաբար, այն համարվում է նոր կենսաբանորեն ակտիվ բնական արտադրանքի ամենակարևոր աղբյուրներից մեկը: Այս ուսումնասիրության ընթացքում մենք հայտնաբերել ենք կումամոնամիդ կոչվող նոր միացություն, որը մեկուսացվել է Streptomyces werraensis MK493-CF1-ից և S. werraensis ISP 5486-ից: Սպեկտրալ վերլուծության և լրիվ սպեկտրալ վերլուծության միջոցով բնութագրվել է կումամոնամիդի կառուցվածքը և որոշվել է դրա եզակի N-ալկօքսիպիրոլային կմախքը: Պարզվել է, որ ուրմոնաթթուն, որը ուրմոնամիդի և դրա ածանցյալների սինթետիկ միջանկյալ է, արգելակում է հայտնի մոդելային բույսի՝ Arabidopsis thaliana-ի աճը և բողբոջումը: Կառուցվածք-ակտիվության փոխհարաբերության ուսումնասիրության մեջ մենք պարզել ենք, որ C9-ով մոդիֆիկացված միացությունը, որը կոչվում է ուրսոնաթթվի նոնիլօքսի ածանցյալ (KAND), զգալիորեն ուժեղացնում է աճի և բողբոջման վրա արգելակող ազդեցությունը: Հատկանշական է, որ նոր հայտնաբերված բույսերի աճի արգելակիչը նաև ազդում էր ծխախոտի և լյարդի խոտի աճի վրա և ցիտոտոքսիկ չէր մանրէների կամ HeLa բջիջների համար: Ավելին, որոշ ուրմոտոնաթթվի ածանցյալներ առաջացնում են արմատային ֆենոտիպի աղավաղում, ինչը ենթադրում է, որ այդ ածանցյալները ուղղակիորեն կամ անուղղակիորեն ազդում են միկրոխողովակների վրա: Այս գաղափարին համապատասխան, իմունահյուսվածքաքիմիական կամ ֆլուորեսցենտ սպիտակուցներով պիտակավորված միկրոխողովակների մեր դիտարկումները ցույց են տալիս, որ KAND-ի բուժումը դեպոլիմերացնում է միկրոխողովակները: Բացի այդ, կումամոտոնաթթվի ածանցյալներով բուժումը խաթարել է ակտինի միկրոթելերը: Այսպիսով, մենք հայտնաբերել ենք բույսերի աճի նոր արգելակիչ, որի գործողության եզակի մեխանիզմը ներառում է ցիտոկմախքի քայքայումը:
MK493-CF1 շտամը մեկուսացվել է Տոկիոյի Շինագավա-կու քաղաքում գտնվող հողից: MK493-CF1 շտամը ձևավորել է լավ ճյուղավորված ստրոմալ միցելիում: Որոշվել է 16S ռիբոսոմային ՌՆԹ գենի մասնակի հաջորդականությունը (1422 զույգ հիմք): Այս շտամը շատ նման է S. werraensis-ին (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 զույգ հիմք, T: տիպիկ շտամ, 99.93%): Այս արդյունքի հիման վրա որոշվել է, որ այս շտամը սերտորեն կապված է S. werraensis տիպի շտամին: Հետևաբար, մենք պայմանականորեն այս շտամը անվանել ենք S. werraensis MK493-CF1: S. werraensis ISP 5486T-ն նույնպես արտադրում է նույն կենսաակտիվ միացությունները: Քանի որ այս միկրոօրգանիզմից բնական արտադրանք ստանալու վաղ հետազոտությունները քիչ էին, իրականացվել են հետագա քիմիական հետազոտություններ: S. werraensis MK493-CF1-ը գարու միջավայրի վրա 30°C ջերմաստիճանում պինդ վիճակում խմորման միջոցով 14 օր մշակելուց հետո, միջավայրը արդյունահանվել է 50% EtOH-ով: 60 մլ նմուշը չորացվել է՝ 59.5 մգ հում քաղվածք ստանալու համար: Հում քաղվածքը ենթարկվել է հակադարձ փուլի HPLC-ի՝ N-մետօքսի-1H-պիրոլ-2-կարբօքսամիդ (1, անվանվել է կումամոնամիդ, 36.0 մգ) ստանալու համար: 1-ի ընդհանուր քանակը կազմում է հում քաղվածքի մոտավորապես 60%-ը: Հետևաբար, մենք որոշեցինք մանրամասն ուսումնասիրել կումամոտոամիդ 1-ի հատկությունները:
Կումամոնամիդ 1-ը սպիտակ ամորֆ փոշի է, և բարձր լուծաչափով զանգվածային սպեկտրոմետրիան (HRESIMS) հաստատում է C6H8N2O2-ը (Նկ. 1): Այս միացության C2-տեղակալված պիրոլի բեկորը բնութագրվում է δH 6.94 (1H, t, J = 2.8, 4.8 Հց, H-4), δH 6.78 (1H, d, J = 2.5, δH 1H NMR սպեկտրում՝ 4.5 Հց, H-5) և δH 6.78 (1H, d, J = 2.5 Հց, H-6) արժեքներով, իսկ 13C NMR սպեկտրը ցույց է տալիս չորս sp2 ածխածնի ատոմների առկայությունը: Ամիդային խմբի առկայությունը C2 դիրքում գնահատվել է HMBC կոռելյացիայի միջոցով՝ C-3 պրոտոնից մինչև ամիդային կարբոնիլային ածխածինը δC 161.1-ում: Բացի այդ, δH 4.10 (3H, S) և δC 68.3 արժեքներում 1H և 13C NMR գագաթները ցույց են տալիս մոլեկուլում N-մետօքսի խմբերի առկայությունը: Չնայած մետօքսի խմբի ճիշտ դիրքը դեռևս չէր որոշվել սպեկտրոսկոպիկ վերլուծության միջոցով, ինչպիսիք են ուժեղացված տարբերությունների սպեկտրոսկոպիան և միջուկային Օվերհաուզերի հապավումը (NOEDF), N-մետօքսի-1H-պիրոլ-2-կարբօքսամիդը դարձավ առաջին թեկնածու միացությունը:
1-ի ճիշտ կառուցվածքը որոշելու համար կատարվել է լրիվ սինթեզ (Նկ. 2ա): Առևտրային առումով մատչելի 2-ամինոպիրիդին 2-ի մշակումը m-CPBA-ով հանգեցրել է համապատասխան N-օքսիդ 3-ի քանակական ելքով: 2-ի 2-ամինոզիդացումից հետո Աբրամովիչի կողմից նկարագրված ցիկլոկոնդենսացման ռեակցիան իրականացվել է բենզոլում 90°C ջերմաստիճանում՝ գրամներով ցանկալի 1-հիդրօքսի-1H-պիրոլ-2-կարբոնիտրիլ 5 ստանալու համար: Արագությունը՝ 60% (երկու փուլ): 15,16. 4-ի մեթիլացումը և հիդրոլիզը այնուհետև տվել են 1-մետօքսի-1H-պիրոլ-2-կարբոնաթթու (կոչվում է «կումոտոնաթթու», 6) լավ ելքով (70%, երկու փուլ): Վերջապես, թթվային քլորիդի միջանկյալ 6-ի միջոցով ամիդացումը՝ օգտագործելով ջրային ամոնիակ, տվել է Կումամոտո ամիդ 1-ը 98% ելքով: Սինթեզված 1-ի բոլոր սպեկտրալ տվյալները նման էին մեկուսացված 1-ի տվյալներին, ուստի որոշվել է 1-ի կառուցվածքը։
Ուրբենամիդի և ուրբենիկ թթվի ընդհանուր սինթեզ և կենսաբանական ակտիվության վերլուծություն։ (ա) Կումամոտո ամիդի լրիվ սինթեզ։ (բ) Յոթօրյա վայրի տեսակի Arabidopsis Columbia (Col) սածիլները աճեցվել են Murashige և Skoog (MS) ափսեների վրա, որոնք պարունակում էին կումամոնամիդ 6 կամ կումամոնամիդ 1՝ նշված կոնցենտրացիաներով։ Չափի սյունը = 1 սմ։
Նախ, մենք գնահատեցինք ուրբենամիդի և դրա միջանկյալ նյութերի կենսաբանական ակտիվությունը՝ բույսերի աճը մոդուլացնելու նրանց ունակության համար: Մենք MS ագարի միջավայրում ավելացրեցինք ուրսմոնամիդ 1-ի կամ ուրսմոնաթթու 6-ի տարբեր կոնցենտրացիաներ և այս միջավայրում կուլտիվացրեցինք Arabidopsis thaliana-ի սածիլները: Այս փորձարկումները ցույց տվեցին, որ 6-ի բարձր կոնցենտրացիաները (500 մկՄ) խոչընդոտում են արմատների աճը (Նկար 2բ): Հաջորդը, մենք ստացանք տարբեր ածանցյալներ՝ փոխարինելով 6-ի N1 դիրքը և կատարեցինք դրանց վրա կառուցվածք-ակտիվության փոխհարաբերությունների ուսումնասիրություններ (անալոգային սինթեզի գործընթացը նկարագրված է Լրացուցիչ տեղեկատվության (SI) մեջ): Arabidopsis-ի սածիլները աճեցվեցին 50 մկՄ ուրսոնաթթվի ածանցյալներ պարունակող միջավայրի վրա, և չափվեց արմատի երկարությունը, ինչպես ցույց է տրված նկարում: Ինչպես ցույց է տրված նկարներ 3ա, բ և S1-ում, կումամաթթուները ունեն գծային ալկօքսի շղթաների տարբեր երկարություններ (9, 10, 11, 12 և 13) կամ մեծ ալկօքսի շղթաներ (15, 16 և 17) N1 դիրքում: Ածանցյալները ցույց տվեցին արմատների աճի զգալի արգելակում: Բացի այդ, մենք պարզեցինք, որ 200 μM 10, 11 կամ 17-ի կիրառումը արգելակեց ծլումը (Նկ. 3c և S2):
Կումամոտոյի ամիդի և դրան առնչվող միացությունների կառուցվածք-ակտիվության կապի ուսումնասիրություն։ (ա) Անալոգների կառուցվածքը և սինթեզի սխեման։ (բ) MS միջավայրում աճեցված 7-օրյա սածիլների արմատի երկարության քանակական որոշումը՝ 50 μM կումամոնամիդային ածանցյալներով կամ առանց դրանց։ Աստղանիշները ցույց են տալիս նշանակալի տարբերություններ կեղծ մշակման հետ (t թեստ, p< 0.05). n>18. Տվյալները ներկայացված են որպես միջին ± ստանդարտ շեղում: nt նշանակում է «չփորձարկված», քանի որ սերմերի ավելի քան 50%-ը չի ծլել: (գ) Մշակված սերմերի ծլման մակարդակի քանակական որոշումը, որը 7 օր ինկուբացվել է MS միջավայրում՝ 200 μM կումամոնամիդով և դրանց հետ կապված միացություններով կամ առանց դրանց: Աստղանիշները ցույց են տալիս կեղծ մշակման հետ կապված նշանակալի տարբերությունները (խի-քառակուսի թեստ): n=96:
Հետաքրքիր է, որ C9-ից երկար ալկիլային կողմնային շղթաների ավելացումը նվազեցրել է արգելակող ակտիվությունը, ինչը ենթադրում է, որ կումամոտոյաթթվի հետ կապված միացությունները պահանջում են որոշակի չափի կողմնային շղթաներ՝ իրենց կենսաբանական ակտիվությունը դրսևորելու համար։
Քանի որ կառուցվածք-ակտիվության փոխհարաբերության վերլուծությունը ցույց տվեց, որ C9-ը մոդիֆիկացված է ուրսոնաթթվի, իսկ ուրսոնաթթվի նոնիլօքսի ածանցյալը (այսուհետ՝ KAND 11) բույսերի աճի ամենաարդյունավետ արգելակիչն է, մենք իրականացրեցինք KAND 11-ի ավելի մանրամասն բնութագրում: Arabidopsis-ի 50 μM KAND 11-ով մշակումը գրեթե ամբողջությամբ կանխեց բողբոջումը, մինչդեռ KAND 11-ի ցածր կոնցենտրացիաները (40, 30, 20 կամ 10 μM) դեղաչափից կախված կերպով արգելակեցին արմատների աճը (Նկար 4ա, բ): Ստուգելու համար, թե արդյոք KAND 11-ը ազդում է արմատի մերիստեմի կենսունակության վրա, մենք ուսումնասիրեցինք պրոպիդիումի յոդիդով (PI) ներկված արմատի մերիստեմները և չափեցինք մերիստեմի մակերեսի չափը: 25 μM KAND-11 պարունակող միջավայրում աճեցված սածիլների մերիստեմի չափը կազմել է 151.1 ± 32.5 մկմ, մինչդեռ DMSO պարունակող վերահսկիչ միջավայրում աճեցված սածիլների մերիստեմի չափը կազմել է 264.7 ± 30.8 մկմ (Նկ. 4գ, դ), ինչը ցույց է տալիս, որ KAND-11-ը վերականգնում է բջջային ակտիվությունը։ Արմատի մերիստեմի տարածումը։ Դրան համապատասխան, KAND 11-ի մշակումը նվազեցրել է բջջային բաժանման մարկեր CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS ազդանշանի քանակը արմատի մերիստեմում (Նկ. 4ե)17: Այս արդյունքները ցույց են տալիս, որ KAND 11-ը կանխում է արմատների աճը՝ նվազեցնելով բջիջների բազմացման ակտիվությունը։
Ուրբենոնաթթվի ածանցյալների (ուրբենիլօքսի ածանցյալներ) աճի վրա արգելակող ազդեցության վերլուծություն: (ա) 7-օրյա վայրի տիպի Col սածիլներ, որոնք աճեցվել են MS ափսեների վրա՝ KAND 11-ի նշված կոնցենտրացիաներով: Սանդղակի գիծը = 1 սմ: (բ) Արմատի երկարության քանակական որոշումը: Տառերը ցույց են տալիս նշանակալի տարբերություններ (Tukey HSD թեստ, էջ< 0.05). n>16. Տվյալները ներկայացված են որպես միջին ± ստանդարտ շեղում: (գ) Պրոպիդիումի յոդիդով ներկված վայրի տիպի Col արմատների կոնֆոկալ մանրադիտակ, որոնք աճեցվել են MS թիթեղների վրա՝ 25 μM KAND 11-ով կամ առանց դրա: Սպիտակ փակագծերը ցույց են տալիս արմատի մերիստեմը: Սանդղակի գիծը = 100 մկմ: (դ) Արմատի մերիստեմի չափի քանակական որոշումը (n = 10-ից 11): Վիճակագրական տարբերությունները որոշվել են t-փորձարկման միջոցով (p< 0.05): Սյուները ներկայացնում են մերիստեմի միջին չափը: (ե) CDKB2 կառուցվածքը պարունակող արմատային մերիստեմի դիֆերենցիալ ինտերֆերենցիալ կոնտրաստի (DIC) մանրադիտակ; 1pro: CDKB2; 1-GUS ներկված և ներկված 5-օրյա սածիլների վրա, որոնք աճեցվել են MS թիթեղների վրա՝ 25 µM KAND անալիզով կամ առանց դրա:
KAND 11-ի ֆիտոթունավորությունը հետագայում ստուգվել է մեկ այլ երկշերտ բույսի՝ ծխախոտի (Nicotiana tabacum) և ցամաքային բույսերի մոդելային օրգանիզմի՝ լյարդային խոտի (Marchantia polymorpha) միջոցով: Ինչպես Arabidopsis-ի դեպքում, 25 μM KAND 11 պարունակող միջավայրում աճեցված ծխախոտի SR-1 սածիլները ավելի կարճ արմատներ են առաջացրել (Նկար 5ա): Բացի այդ, 48 սերմերից 40-ը ծլել են 200 μM KAND 11 պարունակող թիթեղների վրա, մինչդեռ բոլոր 48 սերմերը ծլել են կեղծ մշակված միջավայրում, ինչը ցույց է տալիս, որ KAND-ի ավելի բարձր կոնցենտրացիաները նշանակալի են (p< 0.05; chi թեստ -քառակուսի) արգելակեց ծխախոտի ծլումը: (Նկար 5բ): Բացի այդ, KAND 11-ի կոնցենտրացիան, որը արգելակում էր լյարդի խոտաբույսում մանրէների աճը, նման էր Arabidopsis-ի արդյունավետ կոնցենտրացիային (Նկար 5գ): Այս արդյունքները ցույց են տալիս, որ KAND 11-ը կարող է արգելակել տարբեր բույսերի աճը: Այնուհետև մենք ուսումնասիրեցինք արջի մոնոամիդային միացությունների հնարավոր ցիտոտոքսիկությունը այլ օրգանիզմներում, մասնավորապես՝ մարդու HeLa բջիջներում և Escherichia coli DH5α շտամում, որոնք համապատասխանաբար ներկայացնում են բարձրակարգ կենդանիների և մանրէների բջիջները: Բջջային բազմացման մի շարք փորձարկումներում մենք նկատեցինք, որ կումամոնամիդ 1-ը, կումամոնամիդաթթու 6-ը և KAND 11-ը չեն ազդում HeLa կամ E. coli բջիջների աճի վրա 100 մկՄ կոնցենտրացիաներում (Նկար 5դ,ե):
KAND 11-ի աճի արգելակումը ոչ Arabidopsis օրգանիզմներում: (ա) Երկու շաբաթական վայրի տիպի SR-1 ծխախոտի սածիլները աճեցվել են ուղղահայաց դիրքավորված MS թիթեղների վրա, որոնք պարունակում էին 25 μM KAND 11: (բ) Երկու շաբաթական վայրի տիպի SR-1 ծխախոտի սածիլները աճեցվել են հորիզոնական դիրքավորված MS թիթեղների վրա, որոնք պարունակում էին 200 μM KAND 11: (գ) Երկու շաբաթական վայրի տիպի Tak-1 լյարդախոտի բողբոջներ, որոնք աճեցվել են Gamborg B5 թիթեղների վրա՝ KAND 11-ի նշված կոնցենտրացիաներով: Կարմիր նետերը ցույց են տալիս սպորները, որոնք դադարեցրել են աճը երկշաբաթյա ինկուբացիոն ժամանակահատվածում: (դ) HeLa բջիջների բջիջների բազմացման վերլուծություն: Կենսունակ բջիջների քանակը չափվել է ֆիքսված ժամանակային ընդմիջումներով՝ օգտագործելով բջիջների հաշվարկման հավաքածու 8 (Dojindo): Որպես վերահսկիչ խումբ, HeLa բջիջները մշակվել են 5 μg/մլ ակտինոմիցին D-ով (Act D), որը արգելակում է ՌՆԹ պոլիմերազի տրանսկրիպցիան և առաջացնում է բջիջների մահ: Վերլուծությունները կատարվել են եռակի: (ե) E. coli բջիջների բազմացման վերլուծություն: E. coli-ի աճը վերլուծվել է OD600 չափելով: Որպես վերահսկիչ խումբ, բջիջները մշակվել են 50 մկգ/մլ ամպիցիլինով (Amp), որը արգելակում է բակտերիալ բջջային պատի սինթեզը: Վերլուծությունները կատարվել են եռակի:
Ուրամիդին առնչվող միացությունների կողմից առաջացած ցիտոտոքսիկության գործողության մեխանիզմը վերծանելու համար մենք վերստին վերլուծեցինք ուրբենիկ թթվի ածանցյալներ, որոնք ունեին չափավոր արգելակող ազդեցություն, ինչպես ցույց է տրված նկարում: Ինչպես ցույց է տրված նկարներ 2բ, 6ա-ում, ուրմոտոնիկ թթվի 6 բարձր կոնցենտրացիաներով (200 մկՄ) ագարի թիթեղների վրա աճեցված սածիլները առաջացրին ավելի կարճ և ձախակողմյան կոր արմատներ (θ = – 23.7 ± 6.1), մինչդեռ վերահսկիչ միջավայրում աճեցված սածիլների դեպքում սածիլները առաջացրին գրեթե ուղիղ արմատներ (θ = – 3.8 ± 7.1): Այս բնորոշ թեք աճը, ինչպես հայտնի է, կեղևային միկրոխողովակների դիսֆունկցիայի հետևանք է14,18: Այս հայտնագործությանը համապատասխան, միկրոխողովակները ապակայունացնող դիսոպիրամիդ և օրիզալին դեղամիջոցները մեր աճի պայմաններում առաջացրել են արմատների նմանատիպ թեքություն (Նկար 2բ, 6ա): Միևնույն ժամանակ, մենք փորձարկեցինք ուրմոտոնիկ թթվի ածանցյալներ և ընտրեցինք դրանցից մի քանիսը, որոնք որոշակի կոնցենտրացիաներում առաջացրել են թեք արմատների աճ: 8, 9 և 15 միացությունները փոխեցին արմատների աճի ուղղությունը համապատասխանաբար 75 μM, 50 μM և 40 μM կոնցենտրացիաներով, ինչը ցույց է տալիս, որ այս միացությունները կարող են արդյունավետորեն անկայունացնել միկրոխողովակները (Նկար 2բ, 6ա): Մենք նաև փորձարկեցինք ուրսոլաթթվի ամենաուժեղ ածանցյալը՝ KAND 11-ը, ավելի ցածր կոնցենտրացիայով (15 μM) և պարզեցինք, որ KAND 11-ի կիրառումը կանխում է արմատների աճը, և որ արմատների աճի ուղղությունը անհավասար է, չնայած դրանք հակված են թեքվել դեպի ձախ (Նկար C3): Քանի որ միկրոխողովակները անկայունացնող դեղամիջոցների ավելի բարձր կոնցենտրացիաները երբեմն կանխում են բույսերի աճը, այլ ոչ թե առաջացնում արմատների թեքում, մենք հետագայում գնահատեցինք այն հնարավորությունը, որ KAND 11-ը ազդում է միկրոխողովակների վրա՝ դիտարկելով արմատային էպիդերմալ բջիջների կեղևային միկրոխողովակները: 25 μM KAND 11-ով մշակված սածիլների արմատների էպիդերմալ բջիջներում հակա-β-տուբուլինային հակամարմինների կիրառմամբ իմունահյուսվածքաքիմիական հետազոտությունը ցույց տվեց գրեթե բոլոր կեղևային միկրոխողովակների անհետացումը էպիդերմալ բջիջներում՝ երկարացման գոտում (Նկար 6բ): Այս արդյունքները ցույց են տալիս, որ կումամոտոնաթթուն և դրա ածանցյալները ուղղակիորեն կամ անուղղակիորեն ազդում են միկրոխողովակների վրա՝ խաթարելով դրանք, և որ այս միացությունները նոր միկրոխողովակային ինհիբիտորներ են։
Ուրսոնաթթուն և դրա ածանցյալները փոխում են Arabidopsis thaliana-ի կեղևային միկրոխողովակները: (ա) Արմատի թեքության անկյունը չափված է տարբեր ուրմոտոնաթթվի ածանցյալների առկայությամբ նշված կոնցենտրացիաներում: Վերլուծվել են նաև միկրոխողովակները արգելակող երկու միացությունների՝ դիսոպիրամիդի և օրիզալինի ազդեցությունը: Ներդիրում ներկայացված է արմատի աճի անկյունը չափելու համար օգտագործվող ստանդարտը: Աստղանիշները ցույց են տալիս նշանակալի տարբերությունները կեղծ բուժման հետ (t թեստ, p< 0.05). n>19. Չափսերի գիծ = 1 սմ: (բ) Կեղևային միկրոխողովակներ էպիդերմալ բջիջներում՝ երկարացման գոտում: MS թիթեղների վրա 25 μM KAND 11-ով կամ առանց դրա աճեցված վայրի տիպի Arabidopsis Col արմատների միկրոխողովակները տեսանելի են դարձել իմունահյուսվածքաքիմիական ներկման միջոցով՝ օգտագործելով β-տուբուլինի առաջնային հակամարմիններ և Alexa Fluor-կոնյուգացված երկրորդային հակամարմիններ: Չափսերի գիծ = 10 մկմ: (գ) Արմատային մերիստեմում միկրոխողովակների միտոտիկ կառուցվածքը: Միկրոխողովակները տեսանելի են դարձել իմունահյուսվածքաքիմիական ներկման միջոցով: Միտոտիկ կառուցվածքները, ներառյալ պրոֆազային գոտիները, իլիկները և ֆրագմոպլաստները, հաշվարկվել են կոնֆոկալ պատկերներից: Սլաքները ցույց են տալիս միտոտիկ միկրոխողովակների կառուցվածքները: Աստղանիշները ցույց են տալիս կեղծ բուժման հետ կապված նշանակալի տարբերությունները (t թեստ, p< 0.05). n>9. Սանդղակի չափս = 50 մկմ։
Չնայած Ուրսան ունի միկրոխողովակների ֆունկցիան խաթարելու ունակություն, դրա գործողության մեխանիզմը, ենթադրվում է, որ տարբեր կլինի միկրոխողովակների դեպոլիմերացնող նյութերի տիպիկ գործողության մեխանիզմներից: Օրինակ, միկրոխողովակների դեպոլիմերացնող նյութերի, ինչպիսիք են դիսոպիրամիդը և օրիզալինը, ավելի բարձր կոնցենտրացիաները առաջացնում են էպիդերմալ բջիջների անիզոտրոպ ընդլայնում, մինչդեռ KAND 11-ը՝ ոչ: Բացի այդ, KAND 11-ի և դիսոպիրամիդի համատեղ կիրառումը հանգեցրել է դիսոպիրամիդով առաջացած արմատների աճի համակցված արձագանքի, և դիտվել է KAND 11-ով առաջացած աճի արգելակում (Նկ. S4): Մենք նաև վերլուծել ենք գերզգայուն դիսոպիրամիդ 1-1 (phs1-1) մուտանտի արձագանքը KAND 11-ին: phs1-1-ը ունի ոչ կանոնիկ տուբուլին կինազային կետային մուտացիա և առաջացնում է ավելի կարճ արմատներ, երբ մշակվում է դիսոպիրամիդով9,20: KAND 11 պարունակող ագարային միջավայրում աճեցված phs1-1 մուտանտի սածիլները ունեին ավելի կարճ արմատներ, նման դիսոպիրամիդով աճեցվածներին (նկ. S5):
Բացի այդ, մենք KAND 11-ով մշակված սածիլների արմատային մերիստեմում դիտարկեցինք միտոտիկ միկրոխողովակային կառուցվածքներ, ինչպիսիք են պրոֆազային գոտիները, իլիկները և ֆրագմոպլաստները: CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS-ի դիտարկումներին համապատասխան՝ դիտարկվեց միտոտիկ միկրոխողովակների թվի զգալի նվազում (Նկ. 6c):
KAND 11-ի ցիտոտոքսիկությունը ենթաբջջային լուծաչափով բնութագրելու համար մենք ծխախոտի BY-2 սուսպենզիոն բջիջները մշակել ենք KAND 11-ով և դիտարկել դրանց արձագանքը: Սկզբում մենք KAND 11 ավելացրինք BY-2 բջիջներին, որոնք արտահայտում էին TagRFP-TUA6, որը ֆլուորեսցենտ կերպով նշում է միկրոխողովակները, որպեսզի գնահատենք KAND 11-ի ազդեցությունը կեղևային միկրոխողովակների վրա: Կեղևային միկրոխողովակների խտությունը գնահատվել է պատկերի վերլուծության միջոցով, որը քանակականացրել է ցիտոկմախքային պիքսելների տոկոսը ցիտոպլազմային պիքսելների մեջ: Փորձարկման արդյունքները ցույց են տվել, որ 50 μM կամ 100 μM KAND 11-ով 1 ժամ մշակումից հետո խտությունը զգալիորեն նվազել է համապատասխանաբար մինչև 0.94 ± 0.74% կամ 0.23 ± 0.28%, մինչդեռ DMSO-ով մշակված բջիջների խտությունը կազմել է 1.61 ± 0.34% (Նկար 7ա): Այս արդյունքները համապատասխանում են Arabidopsis-ում դիտարկմանը, որ KAND 11-ով մշակումը առաջացնում է կեղևային միկրոխողովակների դեպոլիմերացում (Նկար 6բ): Մենք նաև ուսումնասիրեցինք BY-2 գիծը՝ GFP-ABD-նշված ակտինային թելիկներով, KAND 11-ի նույն կոնցենտրացիայով մշակումից հետո, և նկատեցինք, որ KAND 11-ով մշակումը խաթարեց ակտինային թելիկները: 50 μM կամ 100 μM KAND 11-ով 1 ժամ մշակումը զգալիորեն նվազեցրեց ակտինային թելիկների խտությունը՝ համապատասխանաբար մինչև 1.20 ± 0.62% կամ 0.61 ± 0.26%, մինչդեռ DMSO-ով մշակված բջիջներում խտությունը կազմում էր 1.69 ± 0.51% (Նկար 2): 7բ): Այս արդյունքները հակասում են պրոպիզամիդի ազդեցությանը, որը չի ազդում ակտինային թելիկների վրա, և լատրունկուլին B-ի ազդեցությանը, որը ակտինային դեպոլիմերիզատոր է, որը չի ազդում միկրոխողովակների վրա (SI նկար S6): Բացի այդ, կումամոնամիդ 1-ով, կումամոնամիդաթթվով 6-ով կամ KAND 11-ով մշակումը չի ազդել HeLa բջիջների միկրոխողովակների վրա (SI նկար S7): Այսպիսով, ենթադրվում է, որ KAND 11-ի գործողության մեխանիզմը տարբերվում է հայտնի ցիտոկմախքի խանգարողներից: Բացի այդ, KAND 11-ով մշակված BY-2 բջիջների մեր մանրադիտակային դիտարկումը բացահայտեց բջջային մահվան սկիզբը KAND 11-ով մշակման ընթացքում և ցույց տվեց, որ Էվանսի կապույտ ներկված մեռած բջիջների համամասնությունը զգալիորեն չի աճել KAND 11-ով մշակումից 30 րոպե անց, մինչդեռ 50 μM կամ 100 μM KAND-ով 90 րոպե մշակումից հետո մեռած բջիջների քանակը համապատասխանաբար աճել է մինչև 43.7% կամ 80.1% (Նկար 7գ): Ամփոփելով՝ այս տվյալները ցույց են տալիս, որ նոր ուրսոլաթթվի ածանցյալ KAND 11-ը բույսերի համար հատուկ ցիտոկմախքի արգելակիչ է՝ նախկինում անհայտ գործողության մեխանիզմով:
KAND-ը ազդում է կեղևային միկրոխողովակների, ակտինային թելիկների և ծխախոտի BY-2 բջիջների կենսունակության վրա: (ա) BY-2 բջիջներում կեղևային միկրոխողովակների վիզուալիզացիա TagRFP-TUA6-ի առկայությամբ: KAND 11-ով (50 մկՄ կամ 100 մկՄ) կամ DMSO-ով մշակված BY-2 բջիջները ուսումնասիրվել են կոնֆոկալ մանրադիտակով: Կեղևային միկրոխողովակների խտությունը հաշվարկվել է 25 անկախ բջիջների միկրոֆոտոներից: Տառերը ցույց են տալիս նշանակալի տարբերություններ (Tukey HSD թեստ, էջ< 0.05): Սանդղակի գիծ = 10 մկմ: (բ) BY-2 բջիջների կեղևային ակտինային թելիկները, որոնք տեսանելի են GFP-ABD2-ի առկայությամբ: KAND 11-ով (50 մկՄ կամ 100 մկՄ) կամ DMSO-ով մշակված BY-2 բջիջները ուսումնասիրվել են կոնֆոկալ մանրադիտակով: Կեղևային ակտինային թելիկների խտությունը հաշվարկվել է 25 անկախ բջիջների միկրոֆոտոներից: Տառերը ցույց են տալիս նշանակալի տարբերություններ (Tukey HSD թեստ, էջ< 0.05): Սանդղակի գիծ = 10 մկմ: (գ) Մեռած BY-2 բջիջների դիտարկումը Էվանսի կապույտ ներկմամբ: KAND 11-ով (50 մկՄ կամ 100 մկՄ) կամ DMSO-ով մշակված BY-2 բջիջները հետազոտվել են պայծառ դաշտի մանրադիտակով: n=3: Սանդղակի գիծ = 100 մկմ:
Նոր բնական արտադրանքի հայտնաբերումը և կիրառումը հանգեցրել է մարդկային կյանքի տարբեր ոլորտներում, այդ թվում՝ բժշկության և գյուղատնտեսության մեջ, զգալի առաջընթացի: Բնական ռեսուրսներից օգտակար միացություններ ստանալու համար իրականացվել են պատմական հետազոտություններ: Մասնավորապես, ակտինոմիցետները հայտնի են որպես նեմատոդների դեմ հակամակաբուծային հակաբիոտիկներ՝ տարբեր երկրորդային մետաբոլիտներ արտադրելու իրենց ունակության շնորհիվ, ինչպիսիք են ավերմեկտինը՝ իվերմեկտինի և բլեոմիցինի և դրա ածանցյալների առաջատար միացությունը, որոնք բժշկական նպատակներով օգտագործվում են որպես հակաքաղցկեղային միջոց21,22: Նմանապես, ակտինոմիցետներից հայտնաբերվել են մի շարք մոլախոտերի դեմ պայքարի միացություններ, որոնցից մի քանիսն արդեն օգտագործվում են առևտրային նպատակներով1,23: Հետևաբար, ակտինոմիցետների մետաբոլիտների վերլուծությունը՝ ցանկալի կենսաբանական ակտիվությամբ բնական արտադրանքները մեկուսացնելու համար, համարվում է արդյունավետ ռազմավարություն: Այս ուսումնասիրության մեջ մենք S. werraensis-ից հայտնաբերեցինք նոր միացություն՝ կումամոնամիդ և հաջողությամբ սինթեզեցինք այն: Ուրսոնաթթուն ուրբենամիդի և դրա ածանցյալների սինթետիկ միջանկյալ է: Այն կարող է առաջացնել արմատների բնորոշ գանգրացում, ցուցաբերել չափավորից մինչև ուժեղ մոլախոտերի դեմ պայքարի ակտիվություն և ուղղակիորեն կամ անուղղակիորեն վնասել բույսերի միկրոխողովակները: Սակայն, ուրմոտոնիկ թթվի գործողության մեխանիզմը կարող է տարբերվել առկա միկրոխողովակային ինհիբիտորներից, քանի որ KAND 11-ը նաև խաթարում է ակտինի թելիկները և առաջացնում բջջային մահ, ինչը ենթադրում է կարգավորող մեխանիզմ, որի միջոցով ուրմոտոնիկ թթուն և դրա ածանցյալները ազդում են ցիտոկմախքային կառուցվածքների լայն շրջանակի վրա։
Ուրբենոնաթթվի հետագա մանրամասն բնութագրումը կօգնի ավելի լավ հասկանալ ուրբենոնաթթվի գործողության մեխանիզմը: Մասնավորապես, հաջորդ նպատակն է գնահատել ուրսոնաթթվի՝ վերականգնված միկրոխողովակներին կապվելու ունակությունը՝ որոշելու համար, թե արդյոք ուրսոնաթթուն և դրա ածանցյալները անմիջականորեն ազդում են միկրոխողովակների վրա և դեպոլիմերացնում դրանք, թե՞ դրանց ազդեցությունը հանգեցնում է միկրոխողովակների անկայունացման: Բացի այդ, այն դեպքում, երբ միկրոխողովակները անմիջական թիրախ չեն, բույսերի բջիջների վրա ուրսոնաթթվի գործողության վայրի և մոլեկուլային թիրախների որոշումը կօգնի ավելի լավ հասկանալ կապակցված միացությունների հատկությունները և մոլեկուլային ակտիվությունը բարելավելու հնարավոր ուղիները: Մեր կենսաակտիվության թեստը բացահայտեց ուրսոնաթթվի եզակի ցիտոտոքսիկ ունակությունը այնպիսի բույսերի աճի վրա, ինչպիսիք են Arabidopsis thaliana-ն, ծխախոտը և լյարդի խոտը, մինչդեռ ո՛չ E. coli-ն, ո՛չ էլ HeLa բջիջները չեն ազդվել: Կենդանիների բջիջների համար քիչ կամ ընդհանրապես թունավորությունը ուրսոնաթթվի ածանցյալների առավելությունն է, եթե դրանք մշակվեն որպես մոլախոտերի դեմ պայքարի միջոցներ՝ բաց գյուղատնտեսական դաշտերում օգտագործելու համար: Իրոք, քանի որ միկրոխողովակները էուկարիոտների տարածված կառուցվածքներ են, բույսերում դրանց ընտրողական արգելակումը մոլախոտերի դեմ պայքարի միջոցների հիմնական պահանջն է: Օրինակ՝ պրոպիզամիդը՝ միկրոխողովակները դեպոլիմերացնող միջոց, որն անմիջապես կապվում է տուբուլինի հետ և կանխում պոլիմերացումը, օգտագործվում է որպես մոլախոտերի դեմ պայքարի միջոց՝ կենդանիների բջիջների նկատմամբ իր ցածր թունավորության պատճառով24: Ի տարբերություն դիսոպիրամիդի, նմանատիպ բենզամիդներն ունեն տարբեր թիրախային առանձնահատկություններ: Բույսերի միկրոխողովակներից բացի, RH-4032-ը կամ բենզօքսամիդը նույնպես համապատասխանաբար կանխում են կենդանիների բջիջների կամ օոմիցետների միկրոխողովակները, իսկ զալիլամիդն օգտագործվում է որպես ֆունգիցիդ՝ իր ցածր ֆիտոթունավորության պատճառով25,26,27: Նոր հայտնաբերված արջը և դրա ածանցյալները ցուցաբերում են ընտրողական ցիտոթունավորություն բույսերի նկատմամբ, սակայն հարկ է նշել, որ հետագա փոփոխությունները կարող են փոխել դրանց թիրախային առանձնահատկությունը՝ հնարավոր է՝ ապահովելով լրացուցիչ ածանցյալներ պաթոգեն սնկերի կամ օոմիցետների վերահսկման համար:
Ուրբենոնաթթվի և դրա ածանցյալների եզակի հատկությունները օգտակար են դրանց մշակման և որպես հետազոտական ​​գործիքների օգտագործման համար: Բույսերի բջջի ձևը վերահսկելու գործում ցիտոկմախքի կարևորությունը լայնորեն ճանաչված է: Նախկինում կատարված ուսումնասիրությունները ցույց են տվել, որ բույսերը զարգացրել են կեղևի միկրոխողովակների կազմակերպման բարդ մեխանիզմներ՝ վերահսկելով միկրոխողովակների դինամիկան՝ մորֆոգենեզը պատշաճ կերպով վերահսկելու համար: Միկրոխողովակների ակտիվության կարգավորման համար պատասխանատու մեծ թվով մոլեկուլներ են բացահայտվել, և դրանց հետ կապված հետազոտությունները դեռևս շարունակվում են3,4,28: Բույսերի բջիջներում միկրոխողովակների դինամիկայի մեր ներկայիս պատկերացումները լիովին չեն բացատրում կեղևի միկրոխողովակների կազմակերպման մեխանիզմները: Օրինակ, չնայած դիսոպիրամիդը և օրիզալինը կարող են ապապոլիմերացնել միկրոխողովակները, դիսոպիրամիդը առաջացնում է արմատների լուրջ աղավաղում, մինչդեռ օրիզալինը ունի համեմատաբար մեղմ ազդեցություն: Ավելին, տուբուլինի մուտացիաները, որը կայունացնում է միկրոխողովակները, նաև առաջացնում են արմատների դեքստրոպտացիա, մինչդեռ պակլիտաքսելը, որը նույնպես կայունացնում է միկրոխողովակների դինամիկան, ոչ: Հետևաբար, ուրսոլաթթվի մոլեկուլային թիրախների ուսումնասիրությունը և բացահայտումը պետք է նոր պատկերացումներ տա բույսերի կեղևի միկրոխողովակների կարգավորման վերաբերյալ: Նմանապես, աղավաղված աճը խթանելու գործում արդյունավետ քիմիական նյութերի, ինչպիսիք են դիսոպիրամիդը, և ավելի քիչ արդյունավետ քիմիական նյութերի, ինչպիսիք են օրիզալինը կամ կումամոտորաթթուն, ապագա համեմատությունները կտրամադրեն հուշումներ այն մասին, թե ինչպես է տեղի ունենում աղավաղված աճը։
Մյուս կողմից, պաշտպանության հետ կապված ցիտոկմախքային վերադասավորումները ուրսոնաթթվի ցիտոտոքսիկությունը բացատրելու մեկ այլ հնարավորություն են: Պաթոգենի վարակը կամ էլիկտորի ներմուծումը բույսերի բջիջներ երբեմն առաջացնում է ցիտոկմախքի քայքայում և հետագա բջջային մահ29: Օրինակ, օոմիցետներից ստացված կրիպտոքսանտինը, ըստ հաղորդումների, խաթարում է միկրոխողովակները և ակտինի թելիկները ծխախոտի բջջային մահից առաջ, նման այն բանին, ինչ տեղի է ունենում KAND բուժման դեպքում30,31: Պաշտպանական ռեակցիաների և ուրսոնաթթվի կողմից առաջացած բջջային ռեակցիաների միջև նմանությունները մեզ հանգեցրին այն վարկածին, որ դրանք առաջացնում են ընդհանուր բջջային գործընթացներ, չնայած ակնհայտ է ուրսոնաթթվի ավելի արագ և ուժեղ ազդեցությունը, քան կրիպտոքսանտինը: Այնուամենայնիվ, ուսումնասիրությունները ցույց են տվել, որ ակտինի թելիկների խաթարումը նպաստում է ինքնաբուխ բջջային մահվան, որը միշտ չէ, որ ուղեկցվում է միկրոխողովակների խաթարմամբ29: Բացի այդ, դեռևս պարզ չէ, թե արդյոք պաթոգենը, թե էլիկտորը առաջացնում են արմատների աղավաղված աճ, ինչպես դա անում են ուրսոնաթթվի ածանցյալները: Այսպիսով, պաշտպանական ռեակցիաները և ցիտոկմախքը կապող մոլեկուլային գիտելիքները գրավիչ խնդիր են, որը պետք է լուծվի: Ուրսոնաթթվի հետ կապված ցածր մոլեկուլային քաշի միացությունների, ինչպես նաև տարբեր ազդեցություններ ունեցող մի շարք ածանցյալների առկայությունը օգտագործելով՝ դրանք կարող են հնարավորություններ ընձեռել անհայտ բջջային մեխանիզմները թիրախավորելու համար։
Միասին վերցրած, միկրոխողովակների դինամիկան կարգավորող նոր միացությունների հայտնաբերումը և կիրառումը կապահովի հզոր մեթոդներ բույսերի բջջի ձևի որոշման հիմքում ընկած բարդ մոլեկուլային մեխանիզմները լուծելու համար: Այս համատեքստում, վերջերս մշակված ուրմոտոնիկ թթու միացությունը, որը ազդում է միկրոխողովակների և ակտինի թելիկների վրա և առաջացնում բջջային մահ, կարող է հնարավորություն տալ վերծանել միկրոխողովակների կառավարման և այս մյուս մեխանիզմների միջև կապը: Այսպիսով, ուրբենոնաթթվի միջոցով քիմիական և կենսաբանական վերլուծությունը կօգնի մեզ հասկանալ բույսերի ցիտոկմախքը կարգավորող մոլեկուլային կարգավորիչ մեխանիզմները:
S. werraensis MK493-CF1-ը ներարկեք 500 մլ միջնորմով Էրլենմայերի սրվակի մեջ, որը պարունակում է 110 մլ սերմնային միջավայր, որը բաղկացած է 2% (w/v) գալակտոզայից, 2% (w/v) էսենցիային մածուկից, 1% (w/v) Bacto կազմից։ -սոյտոն (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0.5% (w/v) եգիպտացորենի քաղվածքից (KOGOSTCH Co., Ltd., Ճապոնիա), 0.2% (w/v) (NH4)2SO4 և 0.2% CaCO3 ապաիոնացված ջրում (pH 7.4 մինչև ստերիլիզացումը)։ Սերմնային կուլտուրաները ինկուբացվել են պտտվող թափահարիչի վրա (180 պտ/րոպե) 27°C ջերմաստիճանում 2 օր։ Արտադրական կուլտուրա՝ պինդ վիճակում խմորման միջոցով։ Սերմնային կուլտուրան (7 մլ) տեղափոխվել է 500 մլ K-1 սրվակի մեջ, որը պարունակում էր 40 գ արտադրական միջավայր, որը բաղկացած էր 15 գ սեղմված գարուց (MUSO Co., Ltd., Ճապոնիա) և 25 գ ապաիոնացված ջրից (pH-ը չի կարգավորվել ստերիլիզացումից առաջ): Խմորումը կատարվել է 30°C ջերմաստիճանում մթության մեջ 14 օրվա ընթացքում: Խմորման նյութը արդյունահանվել է 40 մլ/շիշ EtOH լուծույթով և ցենտրիֆուգացվել է (1500 գ, 4°C, 10 րոպե): Կուլտուրայի վերին շերտը (60 մլ) արդյունահանվել է 10% MeOH/EtOAc խառնուրդով: Օրգանական շերտը գոլորշիացվել է նվազեցված ճնշման տակ՝ մնացորդ (59.5 մգ) ստանալու համար, որը ենթարկվել է HPLC-ի՝ գրադիենտային էլյուցիայով (0–10 րոպե՝ 90%) հակադարձ փուլային սյան վրա (SHISEYDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 մկմ, ID 10 մմ × երկարություն 250 մմ) H2O/CH3CN, 10–35 րոպե՝ 90% H2O/CH3CN-ից մինչև 70% H2O/CH3CN (գրադիենտ), 35–45 րոպե՝ 90% H2O/EtOH, 45–155 րոպե՝ 90% H2O/EtOH-ից մինչև 100% EtOH (գրադիենտ (գրադիենտ), 155–200 րոպե՝ 100% EtOH) 1.5 մլ/րոպե հոսքի արագությամբ, կումամոնամիդը (1, 36.0 մգ) անջատվել է որպես սպիտակ ամորֆ փոշի։
Կումամոտոամիդ(1); 1H-NMR (500 ՄՀց, CDCl3) δ 6.93 (t, J = 2.5 Հց, 1H), 6.76 (dd, J = 4.3, 1.8 Հց 1H), 6.05 (t , J = 3.8 Հց, 1H). ), 4.08 (s, 3H); 13C-NMR (125 ՄՀց, CDCl3) δ 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ հաշվարկված արժեք՝ 141.0659, չափված արժեք՝ 141.0663, IR νmax՝ 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 սմ–1:
Կոլումբիայի սերմերը (Col-0) ձեռք են բերվել Arabidopsis կենսաբանական ռեսուրսների կենտրոնից (ABRC)՝ հետազոտական ​​օգտագործման թույլտվությամբ: Col-0 սերմերը բազմացվել և պահպանվել են մեր լաբորատոր պայմաններում և օգտագործվել են որպես վայրի տեսակի Arabidopsis բույսեր: Arabidopsis սերմերը մակերեսային ստերիլիզացվել են և կուլտիվացվել կիսաամերժ Murashige և Skoog միջավայրում, որը պարունակում է 2% սախարոզ (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0.05% (w/v) 2-(4-մորֆոլինո)էթանսուլֆոնաթթու (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical) և 1.5% ագար (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5.7, 23°C ջերմաստիճանում և մշտական ​​լուսավորության պայմաններում: Phs1-1 մուտանտի սերմերը տրամադրվել են Թ. Հաշիմոտոի կողմից (Նարայի գիտության և տեխնոլոգիայի ինստիտուտ):
SR-1 շտամի սերմերը տրամադրվել են Թ. Հաշիմոտոի կողմից (Նարայի գիտության և տեխնոլոգիայի ինստիտուտ) և օգտագործվել են որպես վայրի տեսակի ծխախոտի բույսեր: Ծխախոտի սերմերը մակերեսային ստերիլիզացվել են և երեք գիշեր թրջվել ստերիլ ջրում՝ ծլումը խթանելու համար, այնուհետև տեղադրվել են կիսաֆաբրիկատային լուծույթի մեջ, որը պարունակում է 2% սախարոզ, 0.05% (w/v) MES և 0.8% գելանային խեժ (Fujifilm Wako Pure Chemical) (Murashige. և Skoog միջավայր)՝ pH 5.7-ով, և ինկուբացվել են 23°C ջերմաստիճանում մշտական ​​լույսի ներքո:
Tak-1 շտամը տրամադրվել է Թ. Կոհչիի կողմից (Կիոտոյի համալսարան) և օգտագործվել է որպես լյարդի խոտաբույսերի ուսումնասիրության ստանդարտ փորձարարական միավոր: Gemma-ն ստացվել է ստերիլիզացված կուլտուրաների բույսերից, այնուհետև տեղադրվել է Gamborg B5 միջավայրի (Fujifilm Wako Pure Chemical) վրա, որը պարունակում էր 1% սախարոզ և 0.3% գելանի խեժ, և ինկուբացվել է 23°C ջերմաստիճանում անընդհատ լույսի ներքո:
Ծխախոտի BY-2 բջիջները (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) տրամադրվել են Ս. Հասեզավայի կողմից (Տոկիոյի համալսարան): BY-2 բջիջները նոսրացվել են 95 անգամ մոդիֆիկացված Լինսմայերի և Սկուգի միջավայրում և շաբաթական լրացվել են 2,4-դիքլորֆենօքսիացախաթթվով 32: Բջջային սուսպենզիան խառնվել է պտտվող թափահարիչի վրա 130 պտ/րոպե արագությամբ 27°C ջերմաստիճանում մթության մեջ: Լվացեք բջիջները թարմ միջավայրի 10 անգամ ավելի ծավալով և վերասուսպենդավորեք նույն միջավայրում: BY-2 տրանսգենային բջջային գծերը, որոնք կայուն արտահայտում են միկրոխողովակային մարկեր TagRFP-TUA6-ը կամ ակտինային թելիկային մարկեր GFP-ABD2-ը ծաղկակաղամբի մոզաիկ վիրուսի 35S պրոմոտորի տակ, ստեղծվել են նկարագրվածի պես33,34,35: Այս բջջային գծերը կարող են պահպանվել և համաժամեցվել՝ օգտագործելով BY-2 բջջային գծի համար օգտագործվածներին նման ընթացակարգեր:
HeLa բջիջները կուլտիվացվել են Դուլբեկոյի մոդիֆիկացված Իգլի միջավայրում (DMEM) (Life Technologies), որը լրացվել է 10% պտղի խոշոր եղջերավոր անասունի շիճուկով, 1.2 U/մլ պենիցիլինով և 1.2 μg/մլ ստրեպտոմիցինով 37°C ինկուբատորում՝ 5% CO2-ով։
Այս ձեռագրում նկարագրված բոլոր փորձերը կատարվել են ճապոնական կենսաանվտանգության կանոնակարգերին և ուղեցույցներին համապատասխան։
Միացությունները լուծվել են դիմեթիլսուլֆօքսիդում (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) որպես հիմնական լուծույթներ և նոսրացվել են MS միջավայրում՝ Arabidopsis-ի և ծխախոտի համար, կամ Gamborg B5 միջավայրում՝ լյարդային խոտի համար: Արմատների աճի արգելակման փորձարկման համար, յուրաքանչյուր ափսեի մեջ ավելի քան 10 սերմ ցանվել է նշված միացությունները կամ DMSO պարունակող ագարի միջավայրի վրա: Սերմերը ինկուբացվել են աճի խցիկում 7 օր: Սածիլները լուսանկարվել են, և չափվել է արմատների երկարությունը: Arabidopsis-ի բողբոջման փորձարկման համար, յուրաքանչյուր ափսեի մեջ 48 սերմ ցանվել է 200 μM միացություն կամ DMSO պարունակող ագարի միջավայրի վրա: Arabidopsis-ի սերմերը աճեցվել են աճի խցիկում, և ծլած սածիլների քանակը հաշվվել է ծլելուց 7 օր անց (dag): Ծխախոտի բողբոջման փորձարկման համար, յուրաքանչյուր ափսեի մեջ 24 սերմ ցանվել է 200 μM KAND կամ DMSO պարունակող ագարի միջավայրի վրա: Ծխախոտի սերմերը աճեցվել են աճի խցիկում, և ծլած սածիլների քանակը հաշվվել է 14 օր անց: Լյարդի սաղմի աճի արգելակման փորձարկման համար յուրաքանչյուր ափսեից 9 սաղմ տեղադրվել է KAND-ի կամ DMSO-ի նշված կոնցենտրացիաները պարունակող ագարի միջավայրի վրա և 14 օր ինկուբացվել է աճի խցիկում։
Արմատային մերիստեմի կազմակերպումը պատկերացնելու համար օգտագործեք 5 մգ/մլ պրոպիդիումի յոդիդով (PI) ներկված սածիլներ: PI ազդանշանները դիտարկվել են ֆլուորեսցենտային մանրադիտակով՝ օգտագործելով TCS SPE կոնֆոկալ լազերային սկանավորող մանրադիտակ (Leica Microsystems):
Արմատների հյուսվածաքիմիական ներկումը β-գլյուկուրոնիդազով (GUS) իրականացվել է Մալամիի և Բենֆեյի36 կողմից նկարագրված արձանագրության համաձայն: Սածիլները գիշերը ֆիքսվել են 90% ացետոնի մեջ, ներկվել են 0.5 մգ/մլ 5-բրոմ-4-քլոր-3-ինդոլիլ-β-d-գլյուկուրոնաթթվով GUS բուֆերում 1 ժամ և տեղադրվել հիդրատացված քլորալդեհիդի լուծույթում (8 գ քլորալ հիդրատ, 2 մլ ջուր և 1 մլ գլիցերին) և դիտարկվել են դիֆերենցիալ ինտերֆերենցիալ կոնտրաստային մանրադիտակով՝ օգտագործելով Axio Imager M1 մանրադիտակ (Carl Zeiss):
Արմատների անկյունները չափվել են ուղղահայաց տեղադրված թիթեղների վրա աճեցված 7-օրյա սածիլների վրա: Չափեք արմատի անկյունը ձգողականության վեկտորի ուղղությունից, ինչպես նկարագրված է 6-րդ քայլում:
Կեղևային միկրոխողովակների դասավորությունը դիտարկվել է նկարագրվածի պես՝ արձանագրության 37-րդ մասում կատարված աննշան փոփոխություններով: Հակա-β-տուբուլինային հակամարմինը (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) և Alexa Fluor 488-ով կոնյուգացված հակամկնային IgG-ն (Thermo Fisher Scientific: A32723) օգտագործվել են որպես առաջնային և երկրորդային հակամարմիններ՝ համապատասխանաբար 1:1000 և 1:100 նոսրացումներով: Ֆլուորեսցենցիայի պատկերները ստացվել են TCS SPE կոնֆոկալ լազերային սկանավորող մանրադիտակի (Leica Microsystems) միջոցով: Z-stack պատկերները ձեռք են բերվել և առավելագույն ինտենսիվության պրոյեկցիաներ են ստեղծվել արտադրողի հրահանգների համաձայն:
HeLa բջիջների պրոլիֆերացիայի թեստը կատարվել է Cell Counting Kit 8 (Dojindo) սարքի միջոցով՝ արտադրողի հրահանգներին համապատասխան։
E. coli DH5α-ի աճը վերլուծվել է բջիջների խտությունը կուլտուրայում չափելով՝ օգտագործելով սպեկտրոֆոտոմետր 600 նմ-ում (OD600):
Տրանսգենային BY-2 բջիջներում ցիտոսկելետային կազմակերպվածությունը դիտարկվել է CSU-X1 կոնֆոկալ սկանավորման սարքով (Yokogawa) և sCMOS տեսախցիկով (Zyla, Andor Technology) հագեցած ֆլուորեսցենտային մանրադիտակի միջոցով: Ցիտոսկելետային խտությունը գնահատվել է պատկերի վերլուծության միջոցով, որը քանակականացրել է ցիտոսկելետային պիքսելների տոկոսը կոնֆոկալ պատկերներում ցիտոպլազմային պիքսելների շարքում՝ օգտագործելով ImageJ ծրագիրը, ինչպես նկարագրված է38,39:
BY-2 բջիջներում բջջային մահը հայտնաբերելու համար բջջային սուսպենզիայի ալիքվոտը 10 րոպե ինկուբացվել է 0.05% Էվանսի կապույտ լուծույթով սենյակային ջերմաստիճանում: Մեռած բջիջների ընտրողական Էվանսի կապույտ ներկումը կախված է կենսունակ բջիջներից ներկանյութի արտամղումից՝ ամբողջական պլազմային թաղանթի միջոցով40: Գունավորված բջիջները դիտարկվել են պայծառ դաշտի մանրադիտակով (BX53, Olympus):
HeLa բջիջները աճեցվել են DMEM-ում՝ լրացված 10% FBS-ով, խոնավացված ինկուբատորում՝ 37°C ջերմաստիճանում և 5% CO2-ով: Բջիջները մշակվել են 100 μM KAND 11-ով, կումամոնամաթթվով 6-ով, կումամոնամիդով 1-ով, 100 նգ/մլ կոլցեմիդով (Gibco) կամ 100 նգ/մլ Nocodmaze-ով (Sigma) 6 ժամ 37°C ջերմաստիճանում: Բջիջները ֆիքսվել են MetOH-ով 10 րոպե, ապա՝ ացետատով՝ 5 րոպե սենյակային ջերմաստիճանում: Ֆիքսված բջիջները ինկուբացվել են β-տուբուլինի առաջնային հակամարմնով (1D4A4, Proteintech: 66240-1), որը նոսրացվել է 0.5% BSA/PBS-ում 2 ժամ, լվացվել են 3 անգամ TBST-ով, ապա ինկուբացվել Alexa Fluor այծի հակամարմնով: 488 1 ժամ: – Մկնիկի IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) և 15 նգ/մլ 4′,6-դիամիդինո-2-ֆենիլինդոլ (DAPI)՝ նոսրացված 0.5% BSA/PBS-ում: TBST-ով երեք անգամ լվանալուց հետո, ներկված բջիջները դիտարկվել են Nikon Eclipse Ti-E շրջված մանրադիտակի վրա: Պատկերները ստացվել են սառեցված Hamamatsu ORCA-R2 CCD տեսախցիկով՝ օգտագործելով MetaMorph ծրագիրը (Molecular Devices):